课件：11胚胎工程实验之体外受精.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ①卵泡抽吸法： 优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染； 缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。 ②卵泡解剖法： 优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率液相对较高； 缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。 * ①腹腔镜法： 优点：比较直观，容易掌握； 缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。 ②B型超声波法： 优点：不用进行手术，操作的速度较快，对母牛的损伤也小，可频繁对母牛进行反复采卵，且亦可对妊娠母牛进行采卵； 缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超升设备。 * ①开放培养系统 采用静止培养系统时，应在成熟培养液中加入一定浓度的FSH（0.1μg/ml），否则会因卵母细胞的严重贴壁而使卵母细胞变形。 优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有影响，且能同时培养大量的卵母细胞，培养结果不受石蜡油质量的影响； 缺点：渗透压的变化较大，容易污染，培养液的量和培养箱的湿度要特别注意。 ②微滴培养系统 优点：成熟培养液中的渗透压比较稳定，且不易污染； 缺点：对培养液中脂溶性物质有稀释作用，且成本较高，培养结果易受石蜡油质量的影响。 ③密闭培养系统： 优点：不需要CO2培养箱，方便运输； 缺点：PH不稳定。 由于这种培养系统不需要昂贵的培养箱，故适合在一些条件简陋的实验室应用，特别是需在卵母细胞的运输途中进行成熟时非常有用。 * * * * * * * * * 母畜生殖道内的获能因子中和 精子表面的去能因子 精子质膜的胆固醇外流 Ca2+进入精子内部 膜的通透性增加 获能完成 膜蛋白重新分布，膜的稳定性 下降 cAMP浓度升高 激活腺苷酸环化酶 抑制磷酸二酯酶 体内获能：把精子送入结扎的子宫角或输卵管中孵育 ① 与血清白蛋白的溶液长时间孵育： 原理是血清中白蛋白具有很强结合胆固醇和锌离子的能力，可除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。 ② 用高离子强度溶液处理精子： 精子表面的去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液处理精子时，将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 ③ 与含有卵泡液的培养液进行孵育： 4. 精子体外获能的方法 ④ 使用钙离子载体A23187： 直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致精子获能。 ⑤ 使用肝素： 是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接近于体内获能的生理性方法，已经成为动物体外受精应用最广的一种精子获能方法。 四、体外受精的方法 体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活的培养系统。 ①微滴法： 是在塑料培养皿中用受精液做成20－40μl的微滴，上覆石蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵母细胞10－20枚及获能处理的精子（1.0－1.5）×106个/ml，在培养箱中孵育6－24h。 ②四孔培养板法： 每孔加入500μl受精液和100－150枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.0－1.5）×106个/ml，而后在培养箱中孵育6－24h。 五、体外受精质量的评定 体外受精成功的判断指标： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通过染色或胚胎培养 六、早期胚胎的体外培养 对于一些采用非手术法将胚胎移植的家畜来说，体外受精后的早期胚胎必须在体外培养至桑椹胚或囊胚阶段才能移植；而对于那些采用手术法移植胚胎的动物，将受精卵培养成囊胚再移植，亦有可能提高移植妊娠率，因体外受精的胚胎并不是都能发育到囊胚阶段。 因此，早期胚胎的体外培养是胚胎体外生产技术中非常关键的一个环节。 （一）胚胎体外培养的发育阻断 随着胚胎的发育，合子的基因开始启动转录，其代谢活动逐步由母源的mRNA控制向合子本身的mRNA控制过渡，在这一过渡时期，胚胎对所处的环境条件特别敏感，稍有不适便表现出不可逆的发育阻断。（门槛） 在进行哺乳动物胚胎体外培养时，若胚胎所处的条件不当，就会出现体外发育阻断，即早期胚胎停顿在某个特定时期，甚至不能发育。 在体内正常的生理条件下，胚胎从输卵管和子