课件：基因治疗生物化学.ppt

* 定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。 （四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) * （五）基因免疫调节 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 * 二、基因治疗的条件 · 对导入的基因及其产物有详尽了解；· 外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达；· 不影响受治细胞基因组及表达调控；导入基因方法安全，载体对靶细胞无害； * 三、基因治疗的原则 对象是病情严重、预后差、别无他法的患者 转移的基因被克隆 无需高水平表达和精确定量控制就有治疗效果 靶细胞获取或回输安全 转移基因表达对细胞微环境无严格特异性要求 * 四、基因疗法的步骤 目的（治疗）基因的选择 根据基因治疗类型选择相应目的基因（增补、替换、添加） 基因载体的构建 使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达 受体细胞选择 易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞 * 基因转移(gene transfer)方法 1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移 * 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导基因转移效率较高 据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。 * 反转录病毒的结构及生活周期 （1）反转录病毒 * （2）腺病毒(adenovirus)载体 通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，尚未发现与肿瘤发生有关联。 * 常用基因治疗载体 ? 整合 致病性 感染细胞 克隆容量 反转录病毒 载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 7kb 腺病毒载体 不整合，可能丢失 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 ? 腺相关病毒载体 定点整合(19号染色体特定区域) 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 5kb 7.5kb * 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 使用方便、成本低廉。 基本原理: 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 * （2）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 * （3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。 * 基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 * 五、基因治疗的应用 治疗恶性肿瘤 治疗黑色素瘤--将已导入IL2基因的TIL细胞回输给病人，启动自身免疫 治疗艾滋病--用射线照射已导入HIV 基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV 感染细胞。 治疗家族性高胆固醇血症（FH） 肝细胞低密度脂蛋白（LDL）受体基因混乱造成，将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞，然后经导管注入