头孢菌素C乙酰化酶的半理性改造及7-ACA的生物合成.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（１２）：６５７１ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 头孢菌素Ｃ乙酰化酶的半理性改造及 ７ＡＣＡ的生物合成 １ １ １ ２ １ １ ２ １ 马晨露 　唐存多 　史红玲 　王　瑞 　岳　超 　夏　敏 　邬敏辰 　阚云超 （１南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室　南阳　４７３０６１　２江南大学无锡医学院　无锡　２１４１２２） 摘要　ＣＰＣ乙酰化酶是一步酶法制备７ＡＣＡ的关键酶，针对它的研究具有重大的经济价值。为 了获得对ＣＰＣ具有更高催化活性的ＣＰＣ乙酰化酶，以ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐＳＥ８３来源的 型ＣＰＣ乙 Ⅲ 酰化酶ＣＡＩＩＩ为亲本，借助分子对接的手段确定了它与ＣＰＣ结合的关键氨基酸残基，并确定将这 些关键氨基酸残基突变为侧链基团更小的氨基酸残基，对ＣＡＩＩＩ的编码基因利用多点定点突变 试剂盒完成定点突变后借助ｐＥＴ３２ａ质粒在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中实现了可溶性表达，获得了对 Ｍ ＣＰＣ催化活性更高的重组突变体ｒｅＣＡＩＩＩ，其比酶活为２６．７ＩＵ／ｍｇ，较原酶提高了３．４４倍。此 Ｍ 外，初步研究了利用ｒｅＣＡＩＩＩ进行一步酶法生产７ＡＣＡ的工艺，４０ＩＵ／ｇＣＰＣ的加酶量、２５℃的 条件下反应１２ｈ，ＣＰＣ的转化率和７ＡＣＡ的得率分别可达９６．３％和６３．４％，表明该酶具有良好 的应用前景。ＣＰＣ乙酰化酶的分子改造上取得的较为理想的结果，为该酶进一步的分子改造及 应用奠定了坚实的基础，也为其它酶的分子改造提供了可资借鉴的经验。 关键词　ＣＰＣ乙酰化酶　生物催化　分子改造　理性设计　活性检测 中图分类号　Ｑ８１９ 　　头孢类抗生素（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）是一类广谱抗生 简化生产工艺、降低生产成本，在工业生产中更具吸引 素，由于其抗菌作用强且有较好的 内酰胺酶耐受性， 力［６７］。 β ［１］ 全球对其的需求也呈上升的趋势 。７氨基头孢烷酸 　　乙酰化酶可以归为五大类型，同一类型中各个成 （７Ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃａｃｉｄ，７ＡＣＡ）是合成半合成 员氨基酸的序列相似度在９０％以上，它们的功能特性 头孢类抗生素的重要中间体，其传统的制备途径是将 ［８］ 也比较相似 ，其中仅有第 和第 类的乙酰化酶具 Ⅰ Ⅲ 头孢菌素Ｃ（ＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎＣ，ＣＰＣ）通过化学方法的脱 ［９］ 有微弱的 ＣＰＣ乙酰化酶活性 ，而 Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ． 乙酰化处理而成，化学法反应条件苛刻、对环境污染 ＡＣＹ９５来源的一个乙酰化酶具有专一的催化ＣＰＣ的活 ［２３］ 大 。与传统的化学方法相比，新型的生物催化法具 ［１０］ 性 ，但是自然界中天然的ＣＰＣ乙酰化酶的活性均较 有安全性高、环境友好、选择性强及设备投入低等优 ［２］