扩展莫尼茨绦虫无精子综合症家族相关基因DAZ的原核表达及组织定位预防兽医学专业论文.docxVIP

石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向 国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少 量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I 目 录 摘 要 II Abstract III 第一部分 文献综述1 一 扩展莫尼茨绦虫病的概述1 1 病原学1 2 形态特征1 3 生活史2 4 致病作用2 5 诊断3 6 治疗与预防3 二 动物寄生虫疫苗研究进展4 1 疟原虫核酸疫苗4 2 血吸虫核酸疫苗5 3 囊尾蚴病和棘球蚴病疫苗5 4 消化道线虫疫苗6 5 原虫病疫苗6 6 展望7 三 模式生物的研究概况8 1 引言8 2 几种经典模式生物8 3 小结9 四 DAZ 基因的研究进展 10 1 前言10 2 DAZ 基因家族的研究现状 10 3 小结12 第二部分 实验内容13 实验一 扩展莫尼茨绦虫虫体的采集、染色及鉴定 13 1 材料与方法13 2 结果14 3 讨论18 4 结论18 实验二 扩展莫尼茨绦虫 DAZ 基因保守结构域的克隆、原核表达与分析 19 1 材料与方法19 2 结果与分析27 3 讨论29 4 结论30 实验三 扩展莫尼茨绦虫石蜡切片的制作及 DAZ 基因的组织定位 31 1 材料与方法31 2 结果与分析33 3 讨论36 参考文献42 附 录 48 II II 摘 要 目的 为了更深入的研究 DAZ 基因与扩展莫尼茨绦虫生殖发育的关系，定位 DAZ 蛋白的表达位点以及分布特点，并以扩展莫尼茨绦虫作为模式生物研究高等生物 甚至人类的生育器官的发育奠定基础，从分子水平掌握扩展莫尼茨绦虫的生长特 点，通过对 DAZ 基因表达产物功能及分布规律的研究，将其作为靶分子研制核 酸疫苗或者寻找它们的抑制物来研发新药，通过控制该基因，减少或者阻止精子 的生成，从而减少虫卵的产生，使其不能排除有效虫卵，对莫尼茨绦虫病的预防 与控制都具有重要意义。 方法 采用苏木素染色法对绦虫虫体进行染色、分离、鉴定出扩展莫尼茨绦虫。 用 Trizol Reagent 提取总 RNA，以逆转录酶 PowerScript 合成第一链 cDNA，参 照 GenBank 中登录的扩展莫尼茨绦虫 DAZ 基因序列设计特异性引物，通过 PCR 技术合成并扩增 DAZ 基因的保守结构域序列，将扩增产物克隆到 pMD19-T 载 体中进行序列测定，测序正确的序列用限制性内切酶 Xho Ⅰ和 SalⅠ进行双酶切， 构建重组质粒 pET28a-DAZ，转入 BL21（DE3）感受态细胞，用 IPTG 进行诱导 表达。表达产物经纯化后用 SDS及 Western blot 分析表达产物。将纯化后 的产物免疫小鼠，免疫程序采用四次免疫，每十天一次，最后用眼球采血的方法 收集血清。根据制备石蜡切片的步骤和方法制备扩展莫尼茨绦虫的石蜡切片，用 收集的血清作为免疫组化的一抗进行 DAZ 蛋白的组织定位。 结果 以扩展莫尼茨绦虫 DAZ 基因阳性质粒为模板，用合成的引物进行 PCR 扩 增，成功扩增出大小约 405 bp 的片段。扩增产物经回收纯化，连接到 pMD19-T Vector 上，转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞，获得含有 DAZ 基因 ORF 片段的 克隆质粒，PCR 和双酶切鉴定结果均显示重组克隆质粒 pMD19T-DAZ 构建正确， 测序结果证实目的片段序列插入正确。构建的阳性重组表达载体 pET28a-DAZ 转入表达宿主 BL21（DE3）中，经 XholⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定，获得 5369 bp （pET-28a 载体）与 405 bp 的目的条带，表明 DAZ 基因 ORF 重组表达质粒构 建成功。重组质粒 pET28a-DAZ 转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 用 IPTG 诱导后 SDS分析结果表明，在约 1