基于循环肿瘤DNA定量KRAS基因突变在结直肠癌诊疗中的应用研究.ppt

项目可行性 实验对象： 温州医科大学附属第二医院肛肠科收集收集的结肠癌病例 样本收集: 1、肿瘤原灶组织 2、血浆ctDNA 前期工作基础 队员参与曾完成《ABCG2基因rs2231142位点多态性与浙南地区人群原发性痛风的相关性研究 》的课题 项目可行性 图9 微滴数量分布图 图11 第一代测序法检测ABCG2基因rs2231142位点基因分型反向测序结果：（A）图为AA型；（B）图为CC型；（C）图为AC型 项目可行性 图10 ddPCR测序法检测ABCG2基因rs2231142位点基因分型结果：（A）图为AA型；（B）图为CC型；（C）图为AC型 实验平台：温州医科大学，浙江省省属高等院校，浙江省重点建设大学，实验室拥有专业实验室面积合计2000多平方米。因此实验室为本课题的进行提供了必备的硬件条件，能够保证本课题的顺利进行。 项目组成员 获奖情况 分别参加2014,2015年浙江省生命学科竞赛均获二等奖； 论文发表 《温州地区消费者对转基因食品的认知调查与分析》； 《腺苷A2AS受体基因对脓毒症肝损伤小鼠肝脏超微结构改变的影响》； 课题项目 负责或参与温州医科大学生本专科科研项目；浙江省新苗计划 工作条件 项目创新点 无创性 实时性 高特异性 高敏感性 项目创新点 实施评估患者的病情进展，克服肿瘤组织异质性 液体活检，取材便捷 精准监控患者用药反应 快速简便检测基因突变 * * * 立项依据 世界卫生组织日前发布，全球结直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者数量正在以惊人的速度不断增加。 我国是结直肠癌的高发国家。 立项依据 图1 2003—2014年中国结直肠癌发病率的变化* ASR (1/105） 我国每年约有120万新发病例，导致约60万患者死亡。 现结直肠癌占国内恶性肿瘤发病率第三位和死亡率第五位。 立项依据 *李道娟,李倩,贺宇彤. 结直肠癌流行病学趋势[J]. 肿瘤防治研究, 2015, 卷缺失(3): 305-310. 万德森. 结直肠癌流行病学与预防[J]. 中国中西医结合外科杂志, 2011, (1): 3-7 CRC靶向药物:表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制剂西妥昔单抗 立项依据 西妥昔单抗对野生型KRAS基因的患者有效 西妥昔单抗对突变型KRAS基因的患者无效 1.样本来源：采用源发病灶组织，操作繁琐，取材创伤大； 2.患者肿瘤组织不同部位分子遗传信息存在差异； 3.患者的疾病不同阶段分子遗传信息存在差异； 4.肿瘤基因稀有突变检测率低； 肿瘤基因突变检测现存在的难点 设计思路 设计思路 肿瘤DNA 肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA, ctDNA）是肿瘤细胞主动分泌或者肿瘤组织破碎、凋亡后进入血液循环系统中，大小通常为160-180bp的DNA片段。 数字微滴PCR：超灵敏的精确定量方法 数字微滴PCR ddPCR 是一种基于单分子模板PCR扩增，进行核算拷贝数精确定量的分析方法。 DNA模版 ddPCR扩增 反应结果读取 目标片段定量 技术 检出限 优点 一代测序 10% 可测全基因序列，价格便宜 实时荧光定量PCR 1% 可测已知位点，价格便宜，条件成熟 等位基因特异性扩增法 0.1% 可测已知位点，方便 全基因组测序 0.1-1% 可测全基因序列，价格较便宜 数字微滴PCR 0.01% 或更低 高灵敏度、高特异性， 现有检测技术比较 表1 现有基因突变检测技术方法比较 本项目提出建立基于ddPCR技术的KRAS基因突变定量检测方法，并将其应用于ctDNA中KRAS基因突变检测及其拷贝数的绝对定量分析，为CRC患者的早期筛查、预后判断、指导临床用药及肿瘤的转移与复发监测提供准确、便捷的实验室依据。 设计思路 图2 ddPCR检测KRAS基因热点突变原理图 设计思路 技术路线与方案 技术路线 临床病例收集 KRAS基因EXON2测序引物设计 CRC患者血液和肿瘤组织中KRAS基因PCR扩增测序 构建（热点突变）野生型和突变型质检 针对热点突变设计ddPCR引物探针 KRAS基因ddPCR定量检测方法的建立及方法的评价 CRC患者ctDNA中KRAS基因突变ddPCR定量检测 比较术前ctDNA与组织中KRAS基因突变检测结果 比较术前与术后24HctDNA中KRAS基因突变的定量结果 动态检测随访CRC患者ctDNA上KRAS基因突变，并与同期CEA结果比较 临床用药指导，预后判断 序效评估 肿瘤转移与复发监测 临