蛋白纯化填料再生试验操作.pdfVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 蛋白纯化填料再生实验操作 亲和层析填料的回收与再生 SOP 镍柱的回收 将使用完的镍柱用对应的含 500mM 咪唑的变性或非变性的洗脱液冲洗至基线。 加入 DDH O冲洗 3—5个柱体积。 2 用 20%的乙醇冲洗 3—5个柱体积。 将其储存在 20%的乙醇中 ，放置 4℃层析柜中等待再生。 镍柱的再生  取待再生的镍柱 ，将其倒入砂芯漏斗中 （实验室的滤孔是 40uM ，大小选择可参考具体的镍柱说明书 ）， 滤除 20%的乙醇。  加入 DDH O冲洗柱子 ，V V =1 5。 2 柱子 H2O  加入 （50mMTris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍 ，0 ）冲洗柱子 ，V 柱子 V 盐酸胍=14。  加入 DDH2O 冲洗柱子 ，V 柱子 VH2O =1 5。  加入 5%SDS冲洗柱子 ，V 柱子 VSDS =12。 （若 SDS析出 ，用 50%乙醇稀释冲洗直至正常 ）  加入 DDH2O 冲洗柱子 ，V 柱子 VH2O =1 5。  加入 （20mM Tris ,100mMEDTA ,PH8.0 ）冲洗柱子 ，直至柱子的颜色由蓝色变成白色 ，V 柱子 VEDTA =1 5 至 1 10。  加入 DDH2O 冲洗柱子 ，V 柱子 VH2O =1 5。 （取少量柱子与考马斯亮蓝 G250反应 ，无颜色变化方可进行 下一步操作 ，若变蓝则继续重复上述步骤 ，直至无颜色反应 ）  加入 100mMNiSO4 于塑料容器中 ，V 柱子 VNiSO4 =13。将其放入 15℃ ，100r/min 的摇床中孵育结合 10 小时以上 （或者过夜 ），静置后滤除 NiSO4 溶液 ，加入等体积的 20%的乙醇放置 4℃层析柜中待用。 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions GST 柱的回收  将使用完的 GST 柱用洗脱缓冲液洗至基线。若洗不掉着用 （50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍 ，0 ） 冲洗柱子至基线。  加入 DDH2O 冲洗 3—5个柱体积。  用 20%的乙醇冲洗 3—5个柱体积。  将其储存在 20%的乙醇中 ，放置 4℃层析柜中等待再生。 GST 柱的再生  取待再生的 GST 柱 ，将其倒入砂芯漏斗中（实验室的滤孔是 40uM ，大小选择可参考具体的 GST 柱说明书 ）， 滤除 20%的乙醇。  加入 DDH2O 冲洗柱子 ，V 柱子 VH2O =1 5。  加入 （50mMTris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍 ，0 ）冲洗柱子 ，V 柱子 V 盐酸胍=14。  加入 DDH2O 冲洗柱子 ，V 柱子 VH2O =1 5。  加入 50%乙醇冲洗柱子 ，V 柱子 V 乙醇 =14。  加入 DDH2O冲洗柱子 ，V 柱子VH2O =1 5。 （取少量柱子与考马斯亮蓝 G250 反应 ，无颜色变化方可进 行下一步操作 ，若变蓝则继续重复上述步骤 ，直至无颜色反应 ）  将其储存在 20%的乙醇中 ，放置 4℃层析柜中待用。 离子交换层析填料的回收与再生 SOP 阴离子/阳离子填料的回收 ：  将使用完的离子柱用对应 PH的含 500mMNaCl 的