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不同培养方式与pH对草地早熟禾原生质体分裂与生长影响 摘要：以3个草地早熟禾品种午夜II号、新格莱德 和橄榄球II号继代培养20次的愈伤组织为材料，设置不同 的pH水平，通过2种培养方式进行了原生质体培养，观测 其原生质体的分裂和生长状况。结果表明：3个草地早熟禾 品种原生质体最适宜的培养方式为固液双层培养，固液双层 培养中液相pH为5. 8 (新格莱德pH6. 0)时原生质体分裂率 达最高值，午夜2号42. 8%、新格莱德50. 1%和橄榄球2号 29. 4%o基因型的差异对于原生质体培养成功与否有着密切 的关系。 关键词：液体浅层培养；固液双层培养；原生质体分 裂率；pH 中图分类号：S 543文献标识码：A文章编号： 1009?5500(2012)01?0050?04 草地早熟禾(Poa pratensis)是禾本科早熟禾属一种 优质冷季型草坪草。草地早熟禾抗寒性较差\[1\],植物生 殖方式复杂多样，常以兼性无融合生殖方式进行繁殖 \[2-6\],有些品种无融合生殖率高达98%以上\[3,6\],有 性杂交率低，很难获得杂种优势品种。以原生质体培养为基 础和前提条件的体细胞杂交技术不失为选育草地早熟禾杂 种细胞可行而有效的育种途径之一。Vander等\[7\]开创了 草地早熟禾原生质体培养的先河，Kisten等\[8\]的研究进 一步奠定草地早熟禾原生质体培养的基础，但目前来看，早 熟禾体细胞杂交技术还不成熟，研究相对不够深入，仅获得 一些阶段性成果\[9, 10\]。 实验以草地早熟禾午夜2号(Midnight II)、新格莱德 (Nuglade)和橄榄球2号(Rugby II) 3个品种的优质愈伤组织 为材料，研究不同培养方式和pH对原生质体分裂和生长的 影响，探索不同品种原生质体的最佳培养方式，以期为进一 步完善草地早熟禾的原生质体培养奠定基础。 1材料和方法 1实验材料 将3个草地早熟禾午夜2号、新格莱德和橄榄球2号品 种的成熟种子接种于添加各品种诱导愈伤组织适宜浓度激 素的MS培养基上(午夜2号:1 mg/L 2,?+0. 3 mg/L 6?BA； 新格莱德：3 mg/L 2,4^D+0. 5 mg/L 6?BA；橄榄球2号：3 mg/L 2,4?)+0. 1 mg/L 6?BA；),诱导并优化培养得到生长 状态质地良好的愈伤组织。 1.2实验方法 挑选各品种继代20次生长状态良好的愈伤组织1 g,置 10 mL酶液(13%甘露醇CPW+1%的纤维素酶+1%的离析酶+0. 3% 的崩溃酶+0.3%的果胶酶和5 mol/L的MES, pH 5.8), 25土 1 °C, 50 r/min摇床暗中酶解16 h。用200目和300 目尼龙网过滤混合液，离心5 min,依次用CPW?13溶液和 原生质体培养液清洗2?3次后用培养液调整原生质体密度 为2X105个/mL后进行培养\[11\]。 用液体浅层培养和固液双层培养进行草地早熟禾原生 质体培养。其中，液体浅层培养以KM8P为基本培养基，添 加不同品种各自愈伤组织诱导时适宜浓度的激素（0.45 urn 微孔滤膜抽滤灭菌），将纯化得到的原生质体悬浮于其中， 滴加2 mL悬浮液到直径6 cm的培养皿底部，形成一薄层， 用保鲜膜封口，于26±1 °C下，恒温培养箱中静置培养；固 液双层培养法：在培养皿底部先铺8?10 mL MS培养基（不 添加激素，pH 5. 8）,再在上面滴加2 mL含有原生质体的KM8P 培养液进行浅层培养，用保鲜膜封口，于26±1 °C下恒温培 养箱中静置培养，每天轻轻晃动培养皿数次，使原生质体与 氧气充分接触。KM8P培养液的pH值设置5. 6、5.8、6. 0共 3个水平。 原生质体培养15 d后在倒置显微镜下统计分裂频率。 比较不同品种的草地早熟禾原生质体的分裂生长及再生能 力差异。 原生质体分裂频率（%） = （分裂的原生质体数/接种原生 质体数）X100 2结果与分析 1不同培养方式及培养基pH对3个品种原生质体分裂 的影响 培养方式和培养基的pH对午夜2号原生质体的分裂生 长均有影响。固液双层培养比液体浅层培养更能得到较高的 原生质体分裂率（图1）。 23个草地早熟禾品种原生质体形态及其变化 原生质体培养初期，3个草地早熟禾品种的原生质体状 态基本相似，在倒置显微镜下观察均表现为形状规则、边缘 清晰、大小均一和内含物较多的特性（图4A）。培养2?3 d 后，可观察到原生质体再生细胞的第1次、第2次分裂（图 4B,C）。随后再生细胞持续分裂，在低倍镜下即可观察到再 生细胞形成的小细胞团（图4D）。比较3个品种原生质体分 裂率发现，新格莱德原生质体的分裂率最高（图2）,午夜2 号略低于新格莱德（图1）,而橄榄球2号原生质体的分裂率 远