课件：二下游技术的理论基础.ppt

生物学过程在下游技术中的应用 亲和色谱是利用了生物物质间的持异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种色谱分离技术。其基本组成如下： 亲和色谱 目标物 生物学过程在下游技术中的应用 具有亲水性 便于载体固定化 非特异吸附很少 有一定的机械强度 常用的载体：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶等。 Sephadex—葡聚糖通过?-1,6结合与交联制备的葡聚糖凝胶 Sepharose—含有半乳糖的琼脂糖凝胶 (Pharmacia 公司) TSK gel—硅胶基质 载体（担体）的选择 亲和色谱 生物学过程在下游技术中的应用 酶的抑制剂：可与被抑制的酶特异性结合 抗体：免疫亲和层析，抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力 A蛋白：A抗原，与动物免疫球蛋白G(IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位为Y字型IgG分子的主干部分（Fc片段），可纯化各种抗体 凝集素：是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称 辅酶和磷酸腺苷：脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用，磷酸腺苷（AMP, ADP, ATP）与辅酶的结构类似 配体和目标物 亲和色谱 三嗪类色素：三嗪类色素与各种需要在NAD(辅酶II)的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合能力，另外还可纯化血清白蛋白、干扰素、核糖酶和糖解酶等。 过渡金属离子：可与N, S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用 组氨酸：具有弱疏水性、其咪唑环为弱电性，可与蛋白质发生亲和结合作用（受PH和盐浓度影响），用来分离等电点相差较大的蛋白 肝素：可纯化脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白等 生物学过程在下游技术中的应用 亲和色谱的操作过程 生物学过程在下游技术中的应用 保证介质对目标物有较高的吸附作用和吸附容量 杂质的非特异吸附要控制在最低水平 影响因素有：目标物和杂质的浓度、缓冲液离子强度和pH值等；提高介质本身的质量；在料液中加入表面活性剂（尤其适用于目标物为疏水性强的蛋白质） 料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素 料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载体来选择 亲和色谱的操作过程 吸附操作 生物学过程在下游技术中的应用 目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时可加入表面活性剂，保证目标物的吸附和杂质的除去。 由于亲和吸附是可逆的，洗涤时间要适中：过度洗涤会引起目标物收率降低；洗涤不够会使目标物纯度下降。 亲和色谱的操作过程 洗涤操作 生物学过程在下游技术中的应用 特异性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标物（例1：t-PA亲和层析，赖氨酸和精氨酸均为其抑制剂；例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌合亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂） 非特异性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类等物化性质降低目标物与亲和介质的吸附能力（例：利用BSA-Sepharose 4B 亲和层析柱分离抗BSA血清中不同抗体） 亲和色谱的操作过程 洗脱操作 作业 Pharmacia 公司介绍及历史变迁 t-PA亲和层析 金属鳌合亲和层析 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 “三传一反”概括了化工生产过程的全部特征。“三传”为动量传递、热量传递和质量传递（化工单元操作），“一反”为化学反应过程。 1楼 TSK-GEL SW系列凝胶色谱柱 TSK-GEL SW系列色谱柱的填料是以刚性的球型硅胶为基质，在其表面通过共价键化学键合亲水基团而成。TSK-GEL SW系列色谱柱的填料具有高性能尺寸排阻色谱所必需的性能，即低吸附性和良好的孔径分布；其pH适用范围为2.5-7.5，可以使用与水完全互溶的有机溶剂，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。TSK-GEL SW系列色谱柱适合用于分析分离蛋白质和多肽类样品，其他应用有大量的文献报道。最经常使用的是10μ m 的TSK-GEL G2000SW，TSK-GEL G3000SW和13μm的TSK-GEL 4000SW 色谱柱；TSK-Gel 2000SWXL和3000 SWxl是5μm，TSK-Gel 4000 SWxl是8μm的高效填料色谱柱；分析型色谱柱的结构可以是玻璃或不锈钢材质。 t-PA 组织纤维溶酶原激活剂 金属螯合亲和层析作用原理 　　固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是