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收稿日期:2016-03-16 录用日期:2016-05-04
*通信作者:wxluo@
doi: 10.6043/j.issn.0438-0479.201603029
一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定
徐灵杰1,罗文新1*,张娟1,周兵2,张天英1,胡耀凯1,袁权2,夏宁邵1
(1. 厦门大学 国家传染病诊断试剂及疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,
2. 厦门大学公共卫生学院,福建 厦门 361102)
摘要:乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球最为重要的公共卫生问题之一,目前临床上治疗HBV的药物在彻底清除病毒方面并没有取得满意的结果,因此迫切需要发展能有效清除病毒、尤其是能有效清除(乙肝表面抗原)HBsAg或大幅度降低HBsAg血清学水平的创新性治疗性药物。本研究筛选到一株针对HBV和HBsAg上的一个特定表位的鼠单抗129G1,它能持续有效清除转基因小鼠体内的乙肝病毒及HBsAg,有发展为治疗性抗体药物的潜力。为了降低129G1的免疫原性,本研究采用(互补决定区)CDR移植的方式、利用噬菌体抗体库技术对这个鼠单抗进行了人源化,最终得到人源化抗体。人源化抗体与HBsAg的结合活性与嵌合抗体相当,1.45 μg/mL的抗体浓度介导THP-1细胞吞噬率达到50%。在HBV转基因小鼠的实验中,人源化抗体能持续有效抑制血清中HBV DNA及清除HBsAg,本研究获得的129G1人源化抗体达到了本研究的目的。
关键词:乙肝病毒;噬菌体抗体库;抗体人源化;抗体药物
中图分类号:Q 511 文献标识码:A
乙型肝炎病毒感染是全球最为重要的公共卫生问题之一,据世界卫生组织统计数据显示,全球约有20亿人感染过HBV,约占世界总人口的1/3,且其中有3.6亿人最终发展成为慢性感染[1,2],每年有将近100万人死于HBV感染及由HBV感染所引发的肝脏疾病[3,4]。其中以中国为代表的一些发展中地区是HBV的高流行区,人群中HBsAg阳性率通常在8%~20%[5]。目前临床上治疗HBV的药物主要包括干扰素类和核苷类似物。干扰素类药物包括普通干扰素及聚乙二醇干扰素,使用后仅有7.8%的患者达到HBsAg血清转换[5],同时因为其可能引发明显的副作用而不能用于长期的治疗;核苷类似物包括拉米夫定、替比夫定等,但使用后HBsAg血清转换率极低,用药两年不到2%,接近自然阴转率,同时它的使用也存在长期治疗过程中会增强病毒抗药性的问题[6]。
治疗性单克隆抗体是今年来快速发展起来的疾病靶向治疗新手段,由于其具有特异性高且均一性好、疗效强、副作用低等优势,已经成为对抗肿瘤、传染病、自身免疫病等疾病的重要工具。在病毒入侵体内产生体内免疫反应时,B细胞应答产生的抗体通过中和(neutralization)和免疫清除(immune clearance)而起到抗病毒作用[7]。HBV感染宿主后产生的抗体主要是Anti-HBs、Anti-HBe和Anti-HBc,其中Anti-HBs属于能够有效阻止病毒感染细胞的中和抗体,这也表明针对HBsAg的抗体可以作为有效治疗慢性乙肝的药物。目前高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播等,但HBIG直接用于治疗慢性HBV感染并未见明显的疗效,且其存在着血浆来源有限、性质不稳定等潜在的安全问题。
所以,本研究希望获得能够有效的清除患者体内HBV病毒及HBsAg水平的治疗性单克隆抗体,以达到治疗慢性乙型肝炎的目的。我们获得一株鼠源单克隆抗体129G1,它是针对HBV表面抗原一个特定表位的抗体,能有效清除转基因小鼠体内的HBV病毒及HBsAg。为了降低免疫源性,我们采用CDR移植的方式、利用噬菌体抗体库技术对这个鼠单抗进行了人源化改造,最终得到一株人源化抗体,在HBV转基因小鼠中能有效的抑制HBV DNA、清除HBsAg,也许将来可为慢性乙肝的治疗提供一种新的手段。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究中所用的大肠杆菌DH5α为实验室保存。ER2738菌株购自New England BioLabs公司。真核表达载体PTT5由本实验制备,噬菌体载体PCGMT由美国Scripps研究所提供,表达细胞株Flp In CHO购自Invitrogen公司。各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自New England BioLabs公司, LA-Taq DNA聚合酶购自TAKARA公司,HRP标记的Anti-M13 IgG (IgG-HRP) 购自GE公司,HRP标记的鼠抗人IgG (IgG-HRP) 及HRP标记的羊抗人IgG (IgG-HRP)、 HBsAg乙肝表面抗原定量试剂盒由北京万泰海沧公司提供。129G1鼠单抗、129G1 cAb由本实验室研制和纯化。
1.2 方法
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