柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基好因csfus3功能鉴定.docx

柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基因。凡髓功能鉴定目 柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基因。凡髓功能鉴定 目 录 摘要 i ABSTRACT 。iii 缩略词表 一v 第一章前言 1 1．1课题的提出 1 1．2植物体细胞胚发生的研究进展 ．1 1．2．1植物体细胞胚发生及其意义 。1 1．2．2植物体细胞胚发生方式 ．2 1．2．2．1无融合生殖 ．．2 1．2．2．2胚外胚胎发生 。3 1．2．2．3小孢子胚胎发生 3 1．2．2．4离体愈伤胚胎发生 3 1．2．3植物体细胞胚发生相关基因研究进展 4 1．2．3．1细胞壁合成及修饰基因 。4 1．2t3．2激素合成和响应基因 5 1．2．3．3信号转导基因 ．．5 1．2．3．4转录因子 6 1．2．4转录组测序技术在植物体细胞胚发生中的应用 ．8 1．2．5柑橘体细胞胚发生研究进展 ．9 1．3本研究的目的和内容 11 第二章柑橘体细胞胚发生及不同组织内参基因筛选 ．．13 2．1引言 ～13 2．2材料与方法 ．14 2-2．1实验材料 14 2．2．1．1‘伏令夏’甜橙非胚性(NEC)愈伤组织的获得 14 2．2．1．2‘伏令夏’甜橙胚性愈伤组织来源及不同温度条件下体细胞胚诱导 14 2．1．1．3‘伏令夏’甜橙其它组织器官的获得 15 2．1．1．4实验所用培养基 15 2．2．2实验方法 16 万方数据 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文2．2．2．1实验材料的分类 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文 2．2．2．1实验材料的分类 ．16 2．2．2．2候选内参基因的选取 ．．16 2．2．2．3总RNA的提取、检测及第一链cDNA合成 。16 2．2．2．4 PCR扩增候选内参基因序列 ．17 2．2．2．5 qRT-PCR检测 ．17 2．2．2．6标准曲线的制备 ．17 2．2．2．7数据分析 ．18 2．2．2．8验证内参基因的可靠性 ．18 2．3结果与分析 ．．18 2．3．1候选内参基因的克隆及引物扩增效率的检测 18 2．3．2候选内参基因表达谱分析 19 2．3．3候选内参基因的表达稳定性分析 19 2．3．3．1 geNorm软件分析 ．22 2．3．3．2 NonnFinder软件分析 ．23 2．3．3．3 Bestkeeper软件分析 26 2．3．3．4综合排序筛选出最合适内参 ．27 2．3．4评价筛选内参的可靠性 27 2．4讨论 31 2．4．1 geNorm、NormFinder和BestKeeper三种应用软件的比较 。31 2．4．2内参基因的筛选问题 32 第三章CsFUS3基因克隆及体细胞胚发生功能鉴定 ．34 3．1引言 34 3．2材料与方法 ．35 3．2．1实验材料的获得 35 3．2．1．1‘伏令夏’甜橙不同组织材料 35 3．2．1．2不同柑橘品种胚性愈伤组织的获得及诱导生胚 ．．35 3．2．1．3不同柑橘品种叶片的获得 ．．35 3．2．1．4检测蛋白定量的材料处理 ．．35 3．2．1．4实验所用培养基 ．．36 3．2．2实验方法 36 3．2．2．1克隆CsFUS3基因的cDNA及DNA全长 。36 Ⅱ 万方数据 柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基因CsFUS3功能鉴定3．2．2．2 柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基因CsFUS3功能鉴定 3．2．2．2 QR毽；基因生物信息学分析 36 3．2．2．3 QFUS3基因Southern拷贝数分析 ．．37 3．2．2．4转录激活实验 37 3．2．2．5 CsFUS3基因的qRT-PCR表达分析 ．37 3．2．2．6 CsFUs3蛋白表达分析 38 3．2．2．7植物转化超量表达载体构建 ．．38 3．2．2．8农杆菌介导的遗传转化及阳性转基因系鉴定 38 3．2．2．9 RNA．seq及数据分析 ．39 3．2．2．10内源激素测定及处理 40 3．2．2．11 ABA及多效唑处理转基因材料 ．．41 3．3结果与分析 ．．42 3．3．1 C旷矾13基因eDNA和DNA全长的克隆 ．．42 3．3．2 CsF唧基因拷贝数分析 ．43 3．3．3 CsFUS3转录激活分析 ．43 3．3．4 CsFUS3基因的表达分析 ．45 3．3．5 CsFUS3蛋白水平的表达 ．．46 3．3．6 CsFUS3能够增强愈伤组织体细胞胚发生能力 ．．47 3．3．7转基因系在体细胞胚发生过程中的转录组分析 48 3．3．8 ABA和(认的测定及处理 58 3．4讨论 。60 3．4．1 CsFUS3通过转录调控和翻译后调控促进体细胞胚发生 ．60 3