柑橘黄字龙病昆虫介体-柑橘木虱的分析及九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建.docx

柑橘黄龙病昆虫媒介．柑橘木虱的研究及九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建摘要 柑橘黄龙病昆虫媒介．柑橘木虱的研究及九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建 摘要 柑橘黄龙病，也称作青果病，是柑橘上最严重的病害之一。黄龙病防治至今还 没有有效的根治方法。柑橘木虱(D卸，厅Dr仂口cf扩f)是黄龙病唯一的传播媒介。九里 香(^缸彻，口p口疗缸“厶口砌)为芸香科植物九里香属植物，是柑橘木虱最喜食的植物之 一，感染黄龙病后很少表现症状。九里香作为抗黄龙病材料已有研究，但关于九里 香感染黄龙病菌后基因表达情况研究很少。 本研究采集田间具有典型黄龙病症状的样品，并对样品嫁接进行室内生物学 鉴定、PCR扩增确定柑橘黄龙病阳性样品。在室外自然条件下研究柑橘木虱对福建 茶和芸香科植物的选择性，观察柑橘木虱在福建茶和九里香上的生活周期，并在室 内条件下研究柑橘木虱不同龄期若虫和成虫的饥渴耐受时间。采用不同浓度海芋乙 醇提取物处理柑橘木虱若虫和成虫，采用夹毒叶片法分别测定提取物对柑橘木虱致 死率，研究海芋提取物对柑橘木虱的生物活性。比较九里香感染黄龙病的不同途径， 找出最佳感染途径后，收集感染黄龙病的九里香作为研究材料，应用SSH方法构建 了九里香感染黄龙病早期的差减cDNA文库，分离获得在黄龙病病程相关的相关的 cDNA片段，从中筛选出与抗性相关的基因片段。利用高效热不对称PCR技术扩增 感染黄龙病菌的九里香的STH．21的cDNA全长，旨在克隆九里香上与黄龙病相关 蛋白的STH．21蛋白的全长定量检测表达情况。 本文主要研究结果如下： 柑橘木虱可在福建茶和九里香上生存繁殖，两者若虫历期和成虫历期差异较 大，福建茶上若虫期(15．O．20d)，成虫期(17．19d)，对照九里香上分别是15．O～17．Od 和20．0～23．Od，福建茶上生活周期和九里香上相近，福建茶上为39．0—44．0d，九里 香为39．O-45．0d九里香上若虫发育为成虫成活率为16．9％。比九里香低。福建茶对 柑橘木虱是一种可接受寄主而不是最适合的寄主．柑橘木虱对寄主选择性测定显示 该虫在选择各寄主之间差异明显，最适寄主为黄皮和九里香，其次是柠檬，沙田柚、 红江橙和桠柑差异不大，很少取食枳壳。耐饥渴能力测试结果表明，低龄若虫和高 龄若虫在供水缺食物时平均存活时间分别为10．O～12．Oh和39．0～40．O h，成虫可存 活69．O～75．Oh；在缺水供食物的条件下，平均存活时间分别为8．0～8．8h和35．0～ 37．Oh，成虫为48．O～50．oh，在缺水缺食物的情况下，平均存活为7．7～8．2 h和15．O～ 18．0左右，成虫为36．O～38．Oh。水分能延长柑橘木虱存活时间，成虫的耐受能力强 华中农业大学20ll届博士学位论文于若虫。海芋挥发性物质和不同浓度乙醇提取物毒杀效果表明：挥发性气体物质O．5h 华中农业大学20ll届博士学位论文 于若虫。海芋挥发性物质和不同浓度乙醇提取物毒杀效果表明：挥发性气体物质O．5h 内对柑橘木虱有强效毒杀作用。各级浓度提取物乙醇溶液对柑橘木虱成虫和若虫均 有不同程度的杀灭效果。10克／100111L对木虱才有很强的毒杀作用，3h时每组死亡 的平均数量为9．3，71l后几乎全部死亡，校正死亡率分别为45．6％和98．4％。提取物 浓度为5克／looInL时，3H和24h后每组的平均校正死亡率分别为23．5％和71．0％。 随着浓度的降低到O．1克／loon儿，平均校正死亡率分别为8．5％和11．5％基本失去了 毒杀作用。 采用汁液摩擦、注射和挤压法，接种2个月后不能在九里香植株体内检测到黄 龙病菌；黄龙病阳性接穗红江橙(C伽姗sinensis Osbec后)嫁接九里香能使黄龙病菌 成功侵染九里香，但接穗不能抽芽。草地菟丝子(C淞c础7叩妒Ps护捃)和虫媒柑橘 木虱p^印厅D，．加口c咖f)都能成功从阳性植株体内将黄龙病菌传播至九里香。柑橘木虱 传“毒”效率结果显示：木虱在红江橙阳性植株上取食1．5h．2h就能携带黄龙病菌，病 原从柑橘木虱传到健康的九里香上最短需要12h，单头木虱带菌就能使九里香成功 感染黄龙病菌。温度对病原的传播效率有较大影响，气温高于35℃或低于15℃时， 介体昆虫活力差，传播病原的效率较低，O℃温度下木虱几乎不传播病原。40℃时昆 虫死亡率高，活力差。 采用抑制差减杂交技术，构建了柑橘黄龙病菌侵染九里香后不同时段的混合样 品SSH正向和反向文库。Nest．PCR结果表明，插入片段大小平均为400 bp大小从 0．2 kb到lkb不等。通过反向Northem斑点杂交技术对两个差减文库中400个片段 进行筛选(正向300个，反向100个)，共获得了167个差异EST表达片段。其中 黄龙病菌诱导寄主上调表达的基因