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基因敲除技术在药学领域中的应用及进展 桑妍蕾(浙江大学医学院附属第一医院药剂科 310003) 【摘要】 基因敲除是自上世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子牛物学 技术，可通过一定途径使机体某种特定的基因失活或缺失，是目前在生物医药领 域对某一具体基因功能研究的热点。木文主要介绍了基因敲除技术的原理及方法, 并对其在药学领域的具体应用进行了综述。 【关键词】 基因敲除 基因同源重组 ES细胞 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752 (2013) 26-0058-02 距离DNA分子双螺旋结构的发现已整整六十年，这六十年里，分子遗 传学、分子免疫学、细胞牛物学等新学科如雨后春笋般地出现，基因重组、小干 扰RNA、原位杂交等分子生物学新技术日新月异地发展，一个乂一个生命的奥秘 从分子角度得到了更清晰地阐明，为进一步揭示生命现象的木质打下了坚实基础。 随着人类基因组工程的进展和完成，21世纪我们己进入后基因组时代。人们利 用己经破译的人类遗传密码，展示了一个崭新的牛物医学研究领域。有针对性地 将某段具有牛物学活性的基因遮盖，使其失去某种牛物学活性，即所谓的基因敲 除技术，是目前在牛物医学领域对某一具体基因功能研究的热点。木文的主旨是 对基因敲除技术的原理、方法、及其在药学领域的相关应用进行初步综述。 一、概念及原理 通常意义上的基因敲除主要指的是基因同源重组，用设计的同源片段替 代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。发牛在同源序列间的重组称为同源重 ^(homologous recombination),又称基木重组。是最基木的DNA重组方式，通 过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比 较成功的有基因的插入突变和免疫核糖核酸(immune RNA, iRNA)0 二、 研究方法 将连接在载体上的改造后的目的基因导入靶细胞后，基因整合成功的靶 细胞将发育成转基因动物。当靶细胞为动物的胚胎干(embryonic stem, ES)细胞 时，外源基因与靶细胞染色体可发生同源重组而实现外源基因的定点、单拷贝整 合，被称为“基因打靶”。在外源基因的3rsquo;■外显子编码区插入编码抗生 素抵抗性蛋白的标志基因，5rsquo;■端启动子区插入目标基因，导入ES细胞后， 发生正确同源重组的细胞具特定的抗生素抗性，能在条件培养基中存活，其他非 目的基因被定点灭活，经此筛选的克隆以显微注射法导入动物胚泡发育成杂合子, 再经过传代筛选得到纯合子，即为“基因敲除”动物。 利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤： 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都垂组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。 ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠。 [1,2] 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同 源的ES细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将 重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。⑶4] 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，目前常用 正负筛选法(positive?negative?selection, PNS法)，标记基因的特异位点表达法 以及聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction, PCR法)。其中应用最多的是 PNS 法。[5] ES注射入囊胚：通过代孕母鼠进行嵌和体小鼠的繁殖。 f?表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基 因变化前后小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的[126]。 g.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中， 所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[7] 三、 在药学研究领域的应用 基因操作技术在药物代谢酶系研究中的应用 细胞色素P450 (cytochromeP450,简称CYP450)药物代谢酶超家族是 生物体内参与各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系，在临床绝人多数治疗药 物以及多种化学性毒物、前致癌物或致突变剂的生物转化作用中占有举足轻重的 地位。长期以来，由于医学伦理学的原因，大量新药的药物代谢动力学及药效学 的结果无法在人体直接观察；而以实验动物为对象的研究结果又由于CYP450酶 系种属间差异的问题，无法直接推及于人。近年来通过基因技术而建立的CYP450 基因敲除以及基因敲入小鼠整体模型，为解决上述问题提供了极大的便利。 利用基因敲除小鼠可观察在特定基因缺失的条件下动物对药物的代谢 情况。目前已建立