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实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化 原理 蔗糖酶(invertase) (?一D一咲喃果糖苜果糖水解酶)(fructofuranoside fructohydrolase) (EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖屮的?一咲喃果糖昔键 水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解牛成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解lmol蔗糖，就生成2mol还原 糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量, 由此可得知蔗糖水解的速度。 + H20 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的 酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能 得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变 性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易 变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保 持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母 中，蔗糖酶含量丰富。木实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热 处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酚，并对英性质进行测定。 蔗 糖酶0 H H 0 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 (-)实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提 供一定量的蔗糖酶。 （二） 实验原理（略） （三） 实验仪器、材料及试剂 仪器 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、一20°C冰箱 电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯 离心管（2ml, 10ml, 30ml 或 50ml）、移液器（lOOOul）或滴管、 量筒 材料及试剂 市售鲜啤酒酵母（低温保存） 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0°C以下） 3.95%乙醇（预冷一20€）、去离子水（使用前冷至4°C左右） Tris-HCI （pH7.3）缓冲液 （四） 操作步骤 提取 （1） 将市售鲜啤酒酵母2000 rpm,离心10 min,除去大量水分。 （2） 将研钵稳妥放入冰浴中。 （3） 称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷 的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次 缓慢加入预冷的10ml去离子水,边加边研蘑以便将蔗糖酶充分转入水相。 共加75ml去离子水，研磨约40^60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时 可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。 （4）将混合物转入50ml （或分装入2个30ml）离心管中，平衡后, 用高速冷冻离心机离心，4°C, 15000rpm, 15mino观察结果：如果屮间 白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。 （4） 用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。 （5） 用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积， 并记录。 （6） 取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I, 一20°C下保存）， 用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。 热处理 （1） 将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50°C恒温水浴中，保持30 分钟，并用玻璃棒温和搅动。 （2） 取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量 大小选择离心管），4°C, 15000rpm,离心15mino （3） 将上清液转入量筒，量出体积，并记录。 （4） 取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II, —20°C下保存）， 用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。 乙醇沉淀 （1） 将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷 的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。 （2） 转入清洁的离心管屮，用4°C, 15000rpm,离心15min,倾去上 清，并滴干。 （3） 离心管中沉淀用5-8mlTris-HCI （pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶 液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积， 并记录。 （4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分III, —20°C下保存）， 用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步 实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱 中冷冻保存，用时再处理） （五） 实验结果与分析 记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。 （六） 注意事项 二、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定 （-）实验目的 学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。 掌握各步骤的实验原理和方法。 （二）实验原理 本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或 酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成瓮酸，碑钳 酸试剂与氧化亚