实验1氨基酸的分离鉴定纸层析法.docxVIP

※实验一氨基酸的分离鉴定一纸层析法 【实验目的】 1、 学习分配层析的原理； 2、 掌握氨基酸纸上层析的操作技术。 【实验原理】 层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质 的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此 固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法2—，运用这种方法可以分离性质极为相似 而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核昔酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、 离子交换层析等。 纸层析属于分配层析法。分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配 系数的不同而得到分离。进行分离时市于被分离物质的组分在两相中的分布不同，因此当流 动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶丁?流动相中的组分移动快，在固定相中溶 解度大的组分移动就慢，于是得到分离。分配层析法屮不同溶质的分离取决于其在两相（固 定相和流动相）间分配系数的不同，分配系数（Q）的定义是： a二溶质在固定相的浓度（CS）/溶质在流动相的浓度（CL） 分配系数愈大，说明溶质在固定相屮的浓度就大，移动的就慢，反Z,溶质移动的就 快。 纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的疑基具有亲水性，能吸附一层水，把吸 附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。层析吋，将样品在距离滤纸2?3cm 的某一处（原点），在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸 在两相中的分配系数不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。 物质被分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上移动的速率用Rf表示。 Rf=原点到层析点中心的距离（X） 4-原点到溶剂前沿的距离（Y）（见图1）。 纸层析中Rf=X/Y在一定条件下某种物质的Rf值是一个 常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶 剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。 纸层析中Rf=X/Y 【器材与试剂】 1、器材（见图2和图3）： 层析缸（或直径20cm、高25cm的标本 缸）1个/小组，点样毛细管6 （个）/小组 或25AL的移液枪，培养皿（直径18cm） 1 个/小组，50mL小烧杯或称量瓶1只/小组， 10ml量筒1个/小组，20ml量筒1个/小组, 喷雾器两个（公用），吹风机4个（公用），塑料薄膜（保鲜膜）（公用），层析滤纸（长 22cm、宽14cm的新华一号滤纸）1张/小组，直尺、铅笔（自备），小托盘、针、白线1套/ 图2图3组（或用昆虫针代替），一次性手套1付/小组，皮套若干。 图2 图3 2、试剂： （1）扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。其中水为固定相，正丁醇为流动相， 乙酸为层析提供酸性环境。） 具体配制方法：将20mL正丁醇和5mL乙酸（4： 1）放入分液漏斗中，与15mL蒸馆 水混合（即所得混合液再按体积比5： 3与蒸饰水混合），充分振荡，静止后分层，放出下层 水层，取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯屮做平衡剂，其余的倒入培养皿屮备用。 注：扩展剂可用75%乙醇代替 （2） 氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、颔氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各 组分的浓度均为0.5%）o （注：几年的实践发现纟颉氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸几种氨基酸层析 的效果不好，几乎不能区分，因此将教材所用的苯丙氨酸去掉。） （3） 显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液。 【操作方法】 （检查玻璃器皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120C烘干。） 1、 制备扩展剂并平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，把盛有约20mL展层溶液的培 养皿和盛有平衡溶剂的小烧杯（或称量瓶）置于塑料薄膜上，然后将层析缸或标本缸倒置于 塑料薄膜上，平衡20mino 2、 准备滤纸 图4带上手套，取宽约14cm、高约22cm的 层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻 轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直 线上做5个记号，记号之间间隔2cm,这就 是原点（点样位置）的位置。另在距左边缘 lcm处画一条平行于左边缘的直线B,在B 线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以 厘米为单位），参见图4。 图4 3、点样： 用毛细管将各氨基酸样品分别点在点样处，干后再点一次。点样量以30~40uL为宜， 点样吋，用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径 不超过3mm o 4、扩展：用线将点好样品的滤纸缝成（或用细的昆虫针将滤纸的两边连接），纸的两 边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。 将制成筒状的滤纸直立于培养皿中（点样的一端朝下，扩展剂的