第十五章基因技术培训课件.ppt

* * * * * * * * * * * * 本年度化学奖的另一半为Gillbert和Sanger获得。 作为物理学家的Gillbert受科学交流的启发，使 用硫酸二甲酯处理DNA， 使DNA中有腺嘌呤和 鸟嘌呤的地方断开，从而获得到一系列不同长度 的脱氧核苷酸片断。分别测定各个片断，最后就 能确定整个DNA中全部脱氧核苷酸的排列顺序。 Berg与基因工程 如果说物理学家Gillbert是用化学方法测定DNA中 脱氧核苷酸的顺序，那么化学家Sanger则是用生物学 中酶的切割作用把RNA切割成小的片段，来测定核苷 酸的排列顺序。他又把DNA双螺旋用酶切割成互补的 许多小片段，在进行特殊的电泳分离测定，从而得知 DNA中脱氧核苷酸的排列顺序。 ? Berg与基因工程 ? 生物体中的DNA会不断进行自我复制。但在生物 体外, 怎样使少量的DNA片段扩增至原来的成千上万 倍，甚至几百万倍呢？ 作为化学家的Mullis在1983 年深夜驾车开过绕山的螺旋形公路时，冒出了一个极 妙的想法，并在1985年成功的付诸实践,这就是“多 聚酶链式反应”，即PCR技术。 Mullis发明PCR技术 这个技术首先根据待扩增的DNA片段两端的脱氧核苷酸序列。 化学合成出两条互补的寡聚脱氧核苷酸引物，引物的作用是使DNA片段扩增。然后将过量的合成引物、四种脱氧核苷酸、DNA合成酶和待扩增的DNA片段混合，先高温变性（使DNA片段双螺旋解开），再进行低温退火（使两种引物各与一条DNA链相连接），和中温延伸（引物加DNA的两条链分别都1变2,2变4,以2n倍速扩增，每一循环才几分钟，几十分钟后就可以使原来的DNA片段扩大几万、几十万甚至一百多万倍，为人类进行微量遗传物质的分析研究提供了极为有效的方法。 Mullis发明PCR技术 Smith是在喝咖啡时，与同事的讨论中想到了一个 进行定点诱变的好主意。这个主意付诸实践就是：先把 有待突变的DNA 克隆到M13噬菌体上。 使之感染细菌， 在细菌体内感染繁殖复制，提取出单链的DNA，加入突 变的引物（合成的寡聚脱氧核糖核苷酸）， 使之与带有 目的DNA单链的M13噬菌体杂交，在加入DNA聚合酶和 四种脱氧核苷酸，使杂交后的突变引物延伸， 经处理后 去感染细菌，从中筛选出带突变DNA序列的突变体。这 就是聚核苷酸定点诱变技术,可以用来对任意已知的DNA 序列进行改变。这项技术改变了过去盲目诱导突变的方 法（如用X光照射）。 Smith建立定点诱变技术 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith (1932 – 2000) La Jolla, CA, USA Kary B. Mullis (1944 - ) University of British Columbia Vancouver Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies 1973年，美国加利福尼亚大学旧金山分校H.Boyer教授和斯坦福大学的S.Cohen教授共同完成了一项著名的实验。他们将两个质粒载体分别用同样的限制性内切酶切成线性分子，然后用DNA连接酶将这两个线性DNA分子连接起来，从而获得了一个新的重组DNA分子。这是人类历史上第一次有目的的基因重组的尝试。并由此提出了“基因克隆”的策略，世界上各国的生物学家立刻意识到这种对DNA进行重组的技术的重大作用和深远意义，在很短的时间内就开发了大量分离、鉴定、克隆基因的方法。 第一个重组质粒 第一个克隆动物 1997年2月23日，苏格兰罗斯林研究所的Ian Wilmut及其团队宣布克隆了多莉羊。全世界和科学家都被该消息震惊。苏格兰科学家将未受精的卵细胞的核去除，将其与成年绵羊细胞的核融合。培养融合卵，然后移植到替代母亲中。这是首次报道从成年动物的DNA克隆动物。 1981年，剑桥大学的Martin Evans， Matthew Kaufman和加州大学旧金山分校的Gail Martin分别独立从培养的母细胞中获得了小鼠胚胎干细