生物制片及显微摄影技术讲义.ppt

生物制片与显微摄影技术 赵艳玲 2013.08 学时学分：18学时，1学分 课程性质：专业必修课/ 任选课 适用专业：生物技术专业 课程内容：讲解植物显微技术的原理和方法，并最终使学生掌握植物石蜡制片的方法及其各个环节的原理和技术要点。 课程安排： 概述讲授1次， 3个学时，了解植物显微制片技术的基本方法、程序和基本原理。 其余时间分为5次实验，共计15学时，系统学习石蜡切片的制片技术，在实验中熟悉、巩固和扩展生物制片的基本理论和技能。 所以本课程是以实验为主的课程。 讲课内容和学时安排： 实验分组：实验中每八至十人组成为一个实验小组。每个实验小组从取材料开始，完成石蜡制片的全过程。如脱水、透明、浸蜡、包埋等环节是全天连续而不能间断的过程，需要实验小组的几个同学轮班完成。每个同学必需了解和掌握各个环节的工作技能。 实验要求：要求每个小组制作合格的石蜡制片不少于20片。每人独立完成实验报告和实验记录，并且独立完成制作切片不少于2片。 成绩评定办法： 成绩由五个部分构成 出勤占20% 。但实验课旷课缺勤一次，扣20分，请假一次扣10分，迟到、早退、未完成预定工作适当扣分。 平时工作及实验的卫生整理情况10%。 实验报告占20% 实验记录20% 制片数量和质量占30% 第一章 绪论 一、生物制片的目的 把想要观察的材料制作成适合于在显微镜下观察的薄片，以显示其组织和细胞的结构。 二、生物制片的类型 显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类。 （一）临时制片 （二）永久制片 （一）临时制片 ?? 多数用于活体制片观察（一种临时制片）。 将生物个体或一部分置于载玻片上，加水和盖玻片进行观察。包括：徒手切片、装片、涂片、解离压片等临时制片。（在植物形态解剖学实验等课程已经讲授，详细过程不再赘述） 优点：简单、省时，能进行活体观察； 缺点：常因组织过厚光线不易透过，活体材料多为无色，未染色观察效果差，不易长期保存。 （二）永久制片 1.切片法 光学显微镜的切片厚度在 2～25微米之间，一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适。 用锋利的刀片将材料切成薄片，便于在显微镜下观察。为了能够切出薄而且完整的切片，对幼嫩的材料（如，幼嫩的根尖、茎尖、叶片等）必须进行包埋，对坚硬的材料（如木材、竹材）必须进行软化而不用包埋。切片法在生物制片技术中最为重要。 切片法分为： （1）徒手切片法 （不用包埋，徒手切片） （2）石蜡切片法 （见后面详述） （3）火棉胶切片法 （4）冰冻切片法 （5）木材切片法 （3）火棉胶切片法 把生物材料经火棉胶包埋后用滑动切片机切片。适用于特别坚硬的材料，或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑）。由于过程复杂，已经较少应用。 火棉胶是一种硝化纤维素，易燃烧。火棉胶可以购买（火棉胶片或火棉胶乙醚或纯酒精液），也可以自制。 自制火棉胶：将照相的底片除去药膜，溶于等量的乙醚或纯酒精中，配制成不同浓度的火棉胶液。 制片原理：材料经过固定、脱水，火棉胶液浸泡，火棉胶包埋，滑动切片机切片，脱胶，染色，脱水，透明封片。 （4）冰冻切片法 特别适用于水分多，柔软，而且容易收缩的材料，如动物组织，用滑动切片机或旋转切片机，配上制冷装置。 半自动冷冻切片机（jx4352525） （5）木材切片法 （滑走切片法、软化切片法）该法适用于坚硬的木材、竹材、骨质的切片。 材料需要软化，常用的软化剂和软化法有： 甘油酒精法 氢氟酸法 醋酸纤维素法 石炭酸软化法 冰醋酸：双氧水（1：2）法 2.非切片法（不用刀） （1）离析法 （2）涂片法 （3）压片法 （4）整体封固法 （5）透明法 （1）离析法 离析液种类很多，最常用的有： 铬酸-硝酸离析液 硝酸-氯化钾离析液 盐酸－草酸氨离析液 氨水离析法 氯化钾（0.01M）或氯化镁（0.01M）离析法 氢氧化钾（或氢氧化钠）离析法 （2）涂片法 适用于单细胞生物或小型的群体藻类、组织疏松或易于分离的植物组织，如花粉囊中的花粉母细胞或花粉粒，根瘤组织、动物的血液等。将生物组织的少许置于载玻片上，涂成薄层后再经不同处理而作成制片，或再用另一片载玻片盖在上面用力压碎。 （3）压片法 将生物组织的一部分置于载玻片上，并隔着盖玻片将其压散开来，而作成制片。 主要用于根尖、茎尖等解离材料的压片，染色体观察。与染色体涂抹法的区别是先把材料固定、软化和染色，再进行压片。 （4）整体封固法