乳与乳制品非常规理化指标检验维生素AE的检测.doc

乳与乳制品非常规理化指标检验维生素AE的检测 YLNB 5.10 1. 范围 用液相色谱法测定各种婴幼儿配方食品和乳粉中的维生素A、E。 2. 方法提要 样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经（用）乙醚萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定。 3. 试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。 3．1 乙醚：脱醛 3．2 甲醇：色谱纯 3．3 异丙醇：色谱纯 3．4 无水乙醇：色谱纯 3．5 无水乙醇：分析纯 3．6 氢氧化钾溶液：质量体积比为500g/L 3．7 抗坏血酸：100g/L 3．8 无水硫酸钠：分析纯 3．9 维生素A、E标准溶液 3．9．1 维生素A标准贮备液，取适量维生素A醋酸酯同5.2处理。 3．9．2 维生素E标准贮备液，含维生素E400μg/mL 的乙醇（3.4 ）溶液。 称取40mg的α-生育酚，用乙醇（3.4 ）溶解并定容于100mL容量瓶中。 称取40mg的δ-生育酚，用乙醇（3.4 ）溶解并定容于100mL容量瓶中。 称取40mg的γ-生育酚，用乙醇（3.4 ）溶解并定容于100mL容量瓶中。 3．9．3 维生素A、E标准工作液。 量取1mL维生素A标准贮备液（3.9.1）和2.5mL维生素E标准贮备液（3.9.2）于100mL容量瓶中，用乙醇（3.4 ）溶解，0.45μm滤膜过滤，滤液作为标准工作溶液。 按照下表中的波长在紫外分光光度计上测定吸收值，并按公式（1）和表中系数计算浓度。 标样 波长（nm） 系数(S) 维生素A (IU/ml) 325 3.33/1835 α-生育酚(μg/ml) 294 71 δ-生育酚(μg/ml) 298 91.2 γ-生育酚(μg/ml) 298 92.8 C(IU/ml或μg/ml)= ………………………公式（1） 式中：C—标样浓度，IU/ml或μg/ml A—在紫外分光光度计上测得的吸光值 S—系数 4. 仪器及器材 常用实验室仪器及： 4．1 圆底烧瓶：250mL。 4．2 分液漏斗：500mL。 4．3 旋转蒸发仪。 4. 4 摇床水浴锅。 4．5 高压液相色谱仪：具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。 4. 6 紫外分光光度计。 5. 方法 5．1 样品处理 精确称取5.0000g样品（液态奶20ml），置于250mL磨口三角瓶中，用水润湿。 5．2 测定液的制备 5．2．1 皂化：于上述处理的样品中加入50mL乙醇溶液（3.5），充分混匀后加15mL氢氧化钾溶液（3.6），再加入5mL抗坏血酸溶液（3.7），在90℃水浴锅中连续回流30min后，立刻冷却到室温。 5．2．2 转移：将皂化液定量转移到500mL分液漏斗中，用少量水分几次冲洗磨口三角瓶，洗涤液并入分液漏斗中。 5．2．3 萃取：于上述分液漏斗中，加入100mL乙醚（3.1），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min，在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中。重复上述萃取过程，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性（用pH试纸测定），通过无水硫酸钠过滤干燥，在50℃水浴和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干），取下，用氮气吹干，用无水乙醇（3.4）定量转移至50mL容量瓶中，定容，0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。 5．3 测定 5．3．1 维生素A和E的测定 5．3．1．1 仪器条件 色谱柱：C18 ，250mm×4.6mm，ODS柱或具等同性能的色谱柱。 流动相：甲醇∶水（98∶2）。 流速：1.0mL/min。 灵敏度：0.005AU/MV。 波长：维生素A，325nm；维生素E，290nm。 5．3．1．2 注射20μL维生素A、E标样（3.9.3）和20μL样品溶液（5.2.3），得到标样和样品溶液中维生素A和E的峰面积。 6. 结果计算 样品中维生素A（IU/100g）= 样品中维生素E（mg /100g）= 式中：m——样品的质量，g； As——样品中维生素A或E的峰面积（或峰高）； Asd——标样中维生素A或E的峰面积（或峰高）； Csd——标样中维生素A或E的浓度，IU/mL（或mg/mL）； V ——定容体积，mL。 计