乳与乳制品病原微生物检验方法粪链球菌群的检测.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法粪链球菌群的检测 YLNB 4.8 1. 仪器及器材 1.1 培养箱：36±1℃ 1.2 冰箱：0~4℃ 1.3 恒温水浴：46±1℃ 1.4 天平 1.5 电炉 1.6 吸管 1.7 广口瓶或三角瓶：容量为500ml 1.8 玻璃珠：直径5mm 1.9 平皿：直径约90mm 1.10 试管 1.11 放大镜 1.12 菌落计数器 1.13 酒精灯 1.14 均质器或乳钵 1.15 试管架 1.16 灭菌刀或剪子 1.17 灭菌镊子 2. 培养基和试剂 2.1：pfrzir肠球菌选择性培养基（PSE）：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。 2.2 ：KF链球菌琼脂：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。 2.3：叠氮化钠葡萄糖肉汤：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。 2.4：生理盐水 2.5：75%乙醇溶液 3. 检验程序 方法一：平板计数法：粪链球菌的检验程序如下： 检样 检样 做成几个适当倍数的稀释液 做成几个适当倍数的稀释液 选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 每个皿内加入适量KF琼脂(或PSE琼脂) 每个皿内加入适量KF琼脂(或PSE琼脂) 36±1℃ 48±2h(或24±2h) 菌落计数 菌落计数 报 告 报 告 3.1 操作步骤 3.1.1 检样稀释及培养 3.1.1.1 以无菌操作将检样25g（或ml）剪碎放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。 3.1.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。 3.1.1.3 另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。 3.1.1.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内。 3.1.1.5 稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的pfrzir肠球菌选择性培养基或kf链球菌培养基（可放置于46±1℃水浴中保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。 3.1.1.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃培养箱内培养48±2h（24±12h）。 3.1.2 菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。粪链球菌在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐，琼脂表面下菌落呈椭圆或晶体状；在PSE平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。选择有30-300个菌落的平板进行计数（菌落计数的报告按照GB/T4789.2的相关条例），按粪链球菌数/g(mL)报告结果。 方法二：多管法： 4.1检验程序： 检 样 检 样 稀 释 稀 释 叠氮化钠葡萄糖肉汤管 叠氮化钠葡萄糖肉汤管 36±1℃，24±2h 混浊混浊不明显不混浊 混浊 混浊不明显 不混浊