乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌的检验 YLNB 4.1 方法一：国标法 1. 仪器及器材 冰箱：0-4℃ 恒温培养箱：36℃±1℃ 显微镜：10×——100× 均质器或灭菌乳钵。 天平：0-500g，精度0.5g 灭菌试管：10mm×100mm、16mm×160mm 灭菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度） 灭菌锥形瓶：500ml、100ml 灭菌培养皿：直径90cm 灭菌L型涂布棒 灭菌刀、剪子、镊子等 培养基和试剂 胰酪胨大豆肉汤：按GB/T4789.28-2003中4.59规定 7.5％氯化钠肉汤：按GB/T4789.28-2003中4.61规定 血琼脂平板：按GB/T4789.28-2003中4.6规定 Baid-Parker琼脂平板：按GB/T4789.28-2003中4.60规定 肉浸液肉汤：按GB/T4789.28-2003中4.1规定 0.85％灭菌生理盐水。 兔血浆：按GB/T4789.28-2003中4.63规定 检验程序： 检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水Baid-Parker平板0.3ml、0.3ml、0.4ml增菌培养方法直接计数方法 检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水 Baid-Parker平板 0.3ml、0.3ml、0.4ml 增菌培养方法 直接计数方法 7.5％氯化钠肉汤或 7.5％氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤 血平板，Baid-Parker平板血平板36℃±1℃ 24h 36℃±1℃ 24h 血平板，Baid-Parker平板 血平板 36℃±1℃ 24h 报告血浆凝固酶试验观察溶血涂片染色36℃±1℃ 24h 报告 血浆凝固酶试验 观察溶血 涂片染色 方法 4.1 增菌培养法 4.2 检样处理：按无菌操作取检样25g（ml）,加入225ml灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。 4.3 增菌及分离培养：吸取5ml上述混悬液，接种于7.5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内，36℃±1℃培养24h，转种于血平板和Baid-Parker平板，36℃±1℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 4.4 形态：本菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄球状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌的菌体较小，直径约为0.5um——1um. 4.5 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baid-Parker平板为圆形，光滑凸起，湿润、直径为2mm——3mm，颜色呈黑色到灰色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶尔会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 4.6 血浆凝固酶试验：吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，在加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 5. 直接计数方法 5.1 吸取上述1：10混悬液，进行，进行10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1ml，分别加入3块Baid-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36℃±1℃1h，等水分蒸发后反转平皿置36℃±1℃培养。 5.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36℃±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。 5.3 菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。 方法二：纸片法 1. 仪器及器材：同方法一中的设备和材料。 2. 培养基和试剂 0.85％灭菌生理盐水 3M Petrifilm (第二代)金黄色葡萄球菌快速检验测试片和确认反应片。按 照操作说明进行贮藏。 3. 方法 检样处理：按无菌操作取检样25g（ml）,加入225ml灭菌生理盐水，固体样 品研磨或置均质器中制成混悬液。 按照3M Petrifilm (第二代)金黄色葡萄球菌快速检验测试片和确认反应 片的操作说明进行操作，