乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌肠毒素的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌肠毒素的检验 YLNB4.2 1. 仪器及器材 1.1德国必发葡萄球菌肠毒素试剂盒 （套） 1.2酶标仪 1.3移液器 Termo Labsystems 50 μL 、100μL 、300μL（多道） 1.4低温离心机及离心管：3500转/分 1.5灭菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度） 1.6 NaH2PO4。H2O、 Na2HPO4。2H2O、NaCI、 n--庚烷 样品前处理2. 检验程序 样品前处理 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架： 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架 加入1 加入100 μL样品(A---G孔)在H孔中，加100 μL阳性对照样到Ｈ孔， 室温 ，1 h 反复洗板（至少３次） 反复洗板（至少３次） 加 加100 μL酶共轭化合物 室温， 1 h 反复洗板（至少３次） 反复洗板（至少３次） 加 加５0 μL的培养基和５0 μL色液体 室温， 0.5 h 加 加100 μL终止液 60min内 测量吸光度值 测量吸光度值 分析结果出报告 分析结果出报告 3. 方法 3.1样品前处理 3.1.1 牛奶：取 10ml样品于离心管内进行低温离心（10min/3500转/10℃）后去除上层油脂层，取上清液1ml，按1：20的比例用蒸馏水稀释后无菌过滤。 3.1.2 面、米、肉、奶油及其他脂肪含量低于40%的食品：取10g样品切碎（最好进行均质），添加15mL缓冲液，调节PH值至7.4，摇匀15min后进行离心（10min/3500转/15℃），如必要去除上层油脂层，过滤。 3.1.3 脂肪含量超过40%的食品：取10g样品切碎（最好进行均质），添加15mL缓冲液，调节PH值至7.4，摇匀15min后进行离心（10min/3500转/15℃），取5mL上层液转移到另一个离心管内，加5mL的n—庚烷，充分混匀后再离心（5min/3500转/15℃），去除上层庚烷层，过滤。 3.2测试操作 3.2.1 把所有试剂在使用之前均放至室温（20—25℃）。 3.2.2 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架上。 3.2.3 加入100 μL样品(A---G孔)，加100 μL阳性到Ｈ孔，用手轻轻摇动，在室温下避光培养1小时。 3. 2. 4 把孔中的液体倒掉，用多道移液器在每个孔中加入250 μL缓冲清洗液冲洗微孔（一排至少3次），从而去除孔中残留的液体。 3. 2. 5 每个孔中加100 μL酶共轭化合物，轻轻摇动，在室温下避光培养1小时。 3. 2. 6把孔中的液体倒掉，用多道移液器在每个孔中加入250 μL缓冲清洗液冲洗微孔（一排至少3次），从而去除孔中残留的液体 3. 2. 7 在每个孔中加50 μL的培养基和５0 μL色液体，轻轻摇动，在室温下避光培养半小时。 3. 2. 8 在每个孔中添加100 μL终止液，摇匀后在450nm处测吸光值。 4. 结果分析 4.1阳性对照样的吸光值应该大于0.5个单位；阴性对照样的吸光值（位于F和G孔）应该等于或小于0.3个单位。如果试验结果不符合以上条件，说明试验失败，必须进行复检。 4.2结果判定如下： 4.2.1 取两个阴性对照样的吸光值的平均值+0.15为参照值。 4.2.2 如果吸光值大于参照值可判为金黄色葡萄球菌肠毒素阳性，小于参考值可判为金黄色葡萄球菌肠毒素阴性。 5. 注意事项 5.1试验过程中必须严格按照清洗步骤进行清洗。 5.2培养过程中要避光。 5.3阳性对照样含有葡萄球状肠毒素，会对人体造成危害，避免直接接触皮肤。 5.4所有接触过阳性对照样的原料应小心处理，玻璃器皿的净化最好用10%的次氯酸钠溶液浸泡。 5.5停止液内含有1N硫酸，避免直接接触皮肤。