ABH唾液型物质凝集抑制试验标准.doc

ABH唾液型物质凝集抑制试验标准 操作规程 (一)检验目的 通过检验分泌型个体唾液中是否存在3H抗原来间接证明受检者红细胞表面是否存在相应ABH抗原，进而辅助证实红细胞表面ABH弱抗原的存在。 (二)检验原理 人类红细胞ABH抗原除在红细胞表面表达以外，约有80％的分泌型个体可以产生水溶性的ABH抗原，这些水溶性抗原可以进入除脑脊液以外的其他体液之中。常规实验室条件下直接检测可溶性抗体存在技术困难，但通过检测可溶性抗原对相应稀释修正过的抗体的抑制作用，间接证实可溶性抗原的存在，从而为证实红细胞表面ABH血型弱抗原的存在提供支持证据。 (三)适用范围 适用于疑似ABO亚型分泌型受检者唾液中A、B、H抗原的检测。 (四)设备性能参数 参见KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机使用说明书。 (五)器材与试剂 1.器材 KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机、酒精灯、广口小烧杯、玻璃大试管、水浴锅、阅片灯箱、硬质塑料试管(75mm×l2mm)、试管架、一次性塑料滴管、100μl移液器、记号笔。 2.试剂 经实验室验证具有抑制活性的单克隆抗A和抗B血清、抗H凝集素或单克隆抗H试剂、单克隆抗Lea和Leb抗体、ABO反定型试剂红细胞、生理盐水、3系或10系或16系谱细胞(用于Lewis血清抗体的阴阳性对照)、已知分泌型或非分泌型的唾液样本(用于抑制试验中的阳性和阴性对照)。 (六)样本要求 1.EDTA-K3或EDTA-K：抗凝静脉血≥3ml经B600-A型离心机在1 760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。 2.受检者新鲜唾液5-10ml。 (七)校准步骤 参照KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机使用说明书中的校准要求执行。 (八)操作程序 1.常规ABO血型鉴定：参考《ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程》进行。 2.对于常规ABO血型鉴定结果不确定，疑似ABO亚型弱抗原存在时，方考虑进行唾液型物质检测： (1)在进行唾液型物质检测前应先确定受检者是否为分泌型：先对受检者外周静脉血标本进行Lewis抗原测定，具体操作步骤请参照对应试剂使用说明书进行。 (2)受检者分泌型的确定原则：ABH分泌型个体通常为Le(a-b+)，非分泌型个体为Le(a+b-)。 3.分泌型个体唾液ABH物质检测 (1)唾液标本的制备：①取一个洁净广口小烧杯收集受检者唾液5～10ml。大多数人可以在几分钟内收集到足够数量的唾液标本。收集唾液时受检者可以咀嚼洁净石蜡或橡皮带等以促进唾液分泌，但不能咀嚼口香糖或其他任何含有糖分或蛋白质成分的物质，防止污染唾液标本。②将收集的唾液转移到洁净的玻璃大试管中，在1 000g条件下，离心10分钟。③将离心后的上清液转移到另外一个玻璃大试管中，放人沸水浴中10分钟，使唾液淀粉酶完全失活。④将沸水煮过的唾液标本再次在1 000g条件下，离心10分钟，留取上清液到另一洁净试管中待用。⑤如果后续试验在几个小时内完成，制备后的唾液标本可以放4℃冷藏；如果试验不在制备当天进行，则应将标本置于-20℃条件下冷冻保存，其标本活力至少可以保持1年以上。 (2)抗A、抗B、抗H血清试剂反应活性的修正：①抗A、抗B、抗H血清连续倍比稀释：分别排列10支试管按顺序编号。每管用移液枪各加生理盐水100μl，在第1管中加入待检抗A(或抗B或抗H)血清100μl，混匀后移出100μl转至第2管，以同样操作稀释至第10管，从第10管吸出100μl暂时保留在另一试管中，以备必要时做进一步稀释。这样从第1管到第10管的血清稀释度依次是1：2，1：4，……1：1 024，移除第10管稀释后的多余的100μl血清单独保存备用。②加红细胞悬液：在每管稀释后的血清中各加3％相应红细胞悬液50μ1，混匀(如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清为抗H，则加入O型标准红细胞悬液)。③离心与结果观察：使用 KA-2200台式离心机在1 000g条件下，离心15秒后观察结果，记录出现最后一个2+的凝集管的稀释倍数。④制备稀释修正血清：根据上步得到的稀释倍数，使用生理盐水将适量抗A、抗B、抗H标准血清分别稀释到相应倍数后待用。 (3)凝集抑制试验：①取4支洁净硬质塑料试管，分别标注“受检者”“分泌型”“非分泌型”及“生理盐水”，前3管分别滴加50μl(1滴)对应的处理后唾液样本，第4管滴加生理盐水。②在4支试管中分别滴加50μl(1滴)