1,25-双羟维生素D3对实验性自身免疫性脊髓炎小鼠自噬饱的调控作用.docxVIP

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河北医科大学 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下,由本人独立完成。本学 位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医科 大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内 容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试验材料、原始数据、申 报的专利等知识产权归河北医科大学所有。否则,承担相应法律责任。 研究生签名:嘲超导师签名:西∥二级学院领导签章:‘ t 。恕年弓月右旧 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中 特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签名:谚勃韶 导师签章:1即力 Ⅻ瞄年≥月汀日 1 万方数据 目 目 录 中文摘要 1 英文摘要 4 英文缩写 8 研究论文 1,25一双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自 噬的调控作用 前言日U舌 9 材料与方法 1 O 结果 1 9 附图 22 讨论 26 结论 29 参考文献 29 综述维生素D、自噬与疾病 33 致谢 42 个人简历 43 万方数据 中文摘要1,25.双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的 中文摘要 1,25.双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的 调控作用 摘 要 目的:多发性硬化不仅是中枢神经系统的自身免疫性疾病,也是一种 神经变性疾病,其发病率和地理纬度具有明显相关性,越远离赤道,多发 性硬化的发病率越高。本实验选用1,25(OH)12D3作为干预药物,研究其治 疗多发性硬化的有效性,不仅研究其对中枢神经系统白质髓鞘的影响,还 深入研究对灰质神经元的作用,并进一步探索其潜在的作用机制。 方法:将27只周龄在8—10周左右,体重在18-209左右的C57BL/6 雌性小鼠随机分为正常对照组,EAE组,VD3组(即1,25(OH)2D3给药组), 各组均为9只。 以MOG多肽为抗原免疫后两组小鼠建立EAE动物模型。以25099 人工合成MOG35.55多肽溶到500p,1生理盐水中,和等体积含lmg/ml结 核菌素的完全福氏佐i}IJ(CFA)混合,加入结核杆菌H37Ra使结核菌素补 充至400ng,充分混匀至油包水乳剂,制成完全抗原,双侧背部分4点皮 下注射。于免疫后的第0和48h两次给予小鼠腹腔内注射500ng的百日咳 毒素,以建立小鼠的EAE模型。免疫当天记为0天。VD3组小鼠自免疫 当天起每隔两日腹腔注射0.1ml 1,25(OH)2D3(用洁净蓖麻油稀释至浓度为 1ug/m1),空白对照组和EAE组小鼠均同天腹腔注射O.1ml蓖麻油,直至 处死。从免疫当天开始,每天早晚(8:oo和16:oo)两次由两位观察者分 别对各组小鼠进行神经功能的评分、称重并给予记录。于免疫后第20天, 对三组小鼠进行取材。断颈处死小鼠后,对小鼠大脑组织新鲜取材,切分 成两部分,前三分之一,后三分之二(此部分以下称为侧脑室旁脑组织), 一部分迅速投入液氮进行快速冷冻,后置于一80℃冰箱保存,进行Western Blot检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3的表达情况;对脊髓腰骶膨大组织 新鲜取材后置于4%多聚甲醛保存,部分制成石蜡切片,进行HE、LFB、 Nissl染色,观察炎性细胞的浸润、脱髓鞘情况及神经元形态数目变化; 剩余部分的侧脑室旁脑组织和腰骶膨大组织则制成冰冻切片,进行免疫荧 光法检测,分别单染NeuN观察神经元的变化,双染NeuN和Beclinl, 万方数据 中文摘要NeuN和LC3,观察神经元自噬水平的变化。 中文摘要 NeuN和LC3,观察神经元自噬水平的变化。 数值采用“均数±标准差”表示,EAE发病率应用Fisher’S确切概率 法,临床评分应用Mann—Whitney U检验。两组间炎性浸润及脱髓鞘对比 应用t检验。多组间的计量资料均数比较应用One—Way ANOVA检验,两 两比较应用SNK.曰检验或Dunnett’S检验。PO.05具有统计学意义。 结果: 1 1,25(OH)2D3有效改善EAE小鼠的临床症状 空白对照组(Control组)小鼠均未发病,活动、食欲等方面均正常。 EAE组小鼠发病率达100%,自免疫第一天即出现不同幅度的体重下降, 之后逐渐出现活动减少、尾巴无力、反应不灵敏和皮毛不光滑等症状。 1,25(OH)2D3治疗组(VD3组)小鼠至取材发病率仅为1 1.1%(尸0.01)。 通过比较后两组中小鼠每天的神经功能评分的均数发现,自第11天开始, VD3组小鼠的神经功能评分显著地低于EAE组小鼠(第11天,P0.05; 之后P

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