PDA_Bavendamm平板法_省略_降解菌及其木质素降解酶活力的测定_应立立.docVIP

PDA-Bavendamm平板法筛选木质素降解菌及其木质素降解酶活力的测定 应立立张建峰王刚李艳丽* (吉林农业大学生命科学学院 吉林长春 130118 摘要:通过PDA-Bavendamm平板法从几株食用菌中筛选木质素降解菌株,以优先降解木质素能力强的菌株为材料,测定了不同浓度玉米秸秆基质中其木质素降解酶活力。结果表明:茶树菇、金针菇、香菇、鲍鱼菇、杏鲍菇及红平菇均具有降解木质素能力,红平菇优先降解木质素的能力最强。以红平菇为材料,发现玉米秸秆浓度为4%时,锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶活力最高,分别为242U/mL和132U/mL;在2%时,漆酶活力最高,为40U/mL。本实验为玉米秸秆木质素的降解及综合开发利用奠定了基础。 关键词:PDA-Bavendamm;木质素降解酶;玉米秸秆 1 前言 玉米秸秆是自然界中重要的可再生资源,可作为燃料能源、工业原料及畜禽饲料[1],使其利用价值大为提高。但目前的现状是:除了少量被利用外,绝大多数都被就地焚烧。近年来,随着环境污染的加剧,人们越来越重视玉米秸秆的利用[2]。玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,结构极其复杂,特别是木质素严重阻碍了玉米秸秆酶解的进行[3],很大程度上影响了玉米秸秆的综合利用。 食用菌可分泌木质素降解酶从而降解环境中的木质素,本研究通过PDA-Bavendamm平板法对几种食用菌木质素降解能力进行了比较,以期筛选木质素降解菌株,并以玉米秸秆为基质,对筛选出的菌株进行木质素降解酶活力的测定,为玉米秸秆木质素的降解及开发利用奠定基础。 2材料与方法 2.1 材料 供试菌株及来源见表1。 表1 供试菌株及来源 菌株名称菌株名称 茶树菇华中农业大学 金针菇华中农业大学 香菇华中农业大学 鲍鱼菇吉林农业大学 杏鲍菇福建三明真菌研究所 红平菇吉林省食用菌高新技术园区 2.2 方法 2.2.1 培养基 PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。 PDA-Bavendamm培养基[4]:PDA培养基中添加0.6805g/L的鞣酸。 以上培养基需在121℃灭菌20min,冷却后备用。 2.2.2木质素降解菌的筛选 将在PDA上活化培养的菌株用打孔器取出,转接至PDA-Bavendamm培养基中央,25℃恒温避光培养。记录菌丝周围棕色变色圈情况。测定菌丝直径d1(mm及变色圈直径d2(mm,计算d1/d2比值。从中筛选出降解木质素能力较强的菌株。 2.2.3不同浓度玉米秸秆液体发酵条件下木质素降解酶活力的测定 分别在PDA液体培养基中加入0%、1%、2%、3%、4%、5%的玉米秸秆粉,接种红平菇菌丝块2块(直径1cm,置于摇床上,25℃,140rpm,恒温避光培养9d。 锰过氧化物酶(MnP活力测定方法[5]:3mM硫酸锰溶液0.1mL,0.1M酒石酸缓冲液(pH4.52.7mL,加入酶液0.1mL,混匀后加入3mM过氧化氢0.1mL启动反应,反应1min时,测定反应液290nm处的吸光值。 木质素过氧化物酶(LiP活力测定方法[6]:3mM黎芦醇溶液0.2mL,0.1M酒石酸缓冲液(pH3.02.3mL,加入酶液0.1mL,混匀后加入3mM过氧化氢0.4mL启动反应,反应1min时,测定反应液310nm处的吸光值。 漆酶活力(Lac测定方法[7]:3mM ABTS溶液0.2mL, 0.1M 酒石酸钠缓冲液(pH4.52.7mL,加入酶液0.1mL 立即启动反应,1min 时,测定反应液420nm 处的吸光值。 以上三种酶活力单位(U/mL 均定义为:每分钟转化1μmol 底物所需的酶量。 3 结果与分析 3.1菌株木质素降解能力的比较 各菌株在PDA-Bavendamm 平板中变色圈结果见表2:茶树菇在培养4d 时出现变色圈,其它菌株在培养1d 时出现变色圈。金针菇变色圈颜色在培养2d 时加深,而其它菌株在培养4d 时颜色加深,培养6d 时,金针菇、香菇、红平菇变色圈颜色均明显加深。上述结果说明:供试菌株均具有降解木质素能力,但茶树菇降解木质素能力较弱,金针菇、香菇、红平菇降解木质素能力较强,其它菌株介于二者之间。因此,选取金针菇、香菇、红平菇继续进行优先降解木质素能力的比较研究。图1显示了金针菇变色圈情况。 表2 PDA-Bavendamm 中各菌株变色圈变色程度 1d 2d 4d 6d 茶树菇 ﹣ ﹣ ﹢ ﹢ 金针菇 ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢香菇 ﹢ ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢鲍鱼菇 ﹢ ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢ 杏鲍菇 ﹢ ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢ 红平菇 ﹢ ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢ 图1 PDA-Bavendamm 平板中金针菇变色圈情况 3.2菌株优先降解木质素能力的比较 三个菌株菌丝直径与变色圈直径的比值d 1/d 2结果如表3所示:培养4d 、6d 时,