DBS32014-2017食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测.pdfVIP

DBS 江 苏 省 地 方 标 准 DBS 32/014—2017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测 2017 - 11 - 27 发布 2017 - 11 - 27 实施 江苏省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS 32/014—2017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157： H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品、巧克力类及可可制品、 即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品、即食调味品、坚果籽实制品等食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单 核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157 ：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的快速检测。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 实时荧光PCR 仪。 2.2 冷冻离心机：12000 r/min，4 ºC 。 2.3 均质器。 2.4 恒温空气振荡摇床：36 ºC±1 ºC、30 ºC±1 ºC、42 ºC±1 ºC 。 2.5 恒温水浴锅：95 ºC±1 ºC 。 2.6 天平：感量0.01 g 。 2.7 冰箱：2 ºC~5ºC 、-20 ºC 。 2.8 微量移液器：0.1 μL-2.5 μL、1 μL-10 μL、10 μL-100 μL、100 μL-1000 μL。 2.9 灭菌吸头：10 μL、200 μL、1000 μL。 2.10 厌氧培养装置。 2.11 灭菌1.5 mL 离心管。 3 试剂与培养基 3.1 PCR 实验用水应符合GB/T 6682 中一级水的规格，121 ºC 高压灭菌30 min 。 3.2 Taq DNA 聚合酶：5 U/μL。 3.3 脱氧核苷酸三磷酸（dNTP ）：10 mmol/L。 3.4 DNA 提取试剂：称取0.1 g chelex 100 粉末，加入灭菌蒸馏水定容至100 mL，保存于-20 ºC 备用； 或使用商品化的DNA 提取试剂盒。 3.5 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl （pH 8.4 ），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。 3.6 引物和探针：引物和探针序列见附录A ，加水稀释至10 μmol/L，其中探针的5’端标记FAM ，3’ 端标记TAMRA 。 3.7 培养基 3.7.1 7.5%氯化钠肉汤：见GB 4789.10 。 1 DBS 32/014—2017 3.7.2 缓冲蛋白胨水（BPW ）：见GB 4789.4 。 3.7.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC ）增菌液：见GB 4789.4 。 3.7.4 四硫磺酸钠煌绿（TTB ）增菌液：见GB 4789.4 。 3.7.5 李氏增菌肉汤LB （LB1 ，LB2 ）：见GB 4789.30 。 3.7.6 改良EC 肉汤 （mEC+n ）：见GB 4789.36 。 3.7.7 3%氯化钠碱性蛋白胨水：见GB 4789.7 。 3.7.8 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB 4789.5 。 4 操作步骤 4.1 样品制备和增菌培养 4.