微生物基因工程2.pptxVIP

第六章 外源基因的表达（二） 6.6 酵母基因表达系统 6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 6.6.2 酵母菌的宿主系统 6.6.3 酵母菌的载体系统 6.6.4 酵母菌的转化系统 6.6.5 酵母菌的表达系统 6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物6.6.2 酵母菌的宿主系统提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI 1 编码泛素--羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达、稳定期关闭UBI 2 编码泛素--羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达、稳定期关闭UBI 3 编码泛素--羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达、稳定期关闭UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭、稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。 UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。6.6.3酵母菌的载体系统酵母菌中的野生型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pGKL1和pGKL2拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母菌致死的毒素蛋白编码基因（αβγ），同时含有毒素蛋白抗性基因。酵母菌克隆表达载体的类型YRp -- 酵母菌复制型质粒YEp -- 酵母菌游离型质粒YCp -- 酵母菌着丝粒质粒YIp -- 酵母菌整合型质粒YLp -- 酵母菌线性型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp含有酵母菌固有质粒2μ环序列的的YRp质粒的构建 以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCpp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均