蔗糖酶米氏常数的测定.ppt

【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = 米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的作图法(双倒数作图法)。 米氏方程式可改写为下列倒数形式： 选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。 ;[S];还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：;【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1 mg/mL） 3%蔗糖溶液（87.7 mM） 0.2 mol/L NaAc缓冲溶液（pH4.6） 0.5 mol/L NaOH溶液 3,5-二硝基水杨酸试剂;【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定;取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。;反应物