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实验8 赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成 P158-160 实验目的 通过实验深入了解赤霉素在种子萌发过程中的调控作用并掌握测定α-淀粉酶活性的一种简便方法。 实验原理 淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中α-淀粉酶基因的表达，引起α-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为还原糖。外源赤霉素能代替胚，诱导糊粉层中α-淀粉酶的形成。 实验原理 实验原理 α–淀粉酶在pH3.6以下则发生钝化，β–淀粉酶在高温下易钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。 淀粉水解产生的麦芽糖，在碱性溶液中能将3，5–二硝基水杨酸还原为3–氨基–5–硝基水杨酸，依此可进行酶活力的测定，也可通过碘试法比色测定淀粉在酶催化反应过程中的消耗量，定量分析α-淀粉酶的活力。 α淀粉酶和β淀粉酶之间的异同 α-淀粉酶是一种内切葡糖苷酶，随机作用于淀粉链内部的α-1,4糖苷键。降解直链淀粉产物是葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖。降解支链淀粉产物是葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和α-极限糊精。 β-淀粉酶是一种外切葡糖苷酶，从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，逐个除去二糖单位，原来的α连接被转型，产物为β-麦芽糖，所以此酶被称为β-淀粉酶。当其降解支链淀粉或糖原时，产物为麦芽糖和β-极限糊精 α淀粉酶和β淀粉酶之间的异同 器材与试剂 ◆实验仪器： 分光光度计、恒温箱、恒温水浴锅、移液管、烧杯、试 管、青霉素小瓶、镊子、刀片。 ◆实验试剂： 1%次氯酸钠溶液、赤霉素溶液（少量乙醇助溶）、0.1%淀粉磷酸溶液（1g淀粉，8.16gKH2PO4,至1000mL）、 10–3mol·L-1醋酸缓冲液、I2-KI溶液 ◆实验材料： 大麦种子 实验步骤 1.选取大小一致、健康的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切成两半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，分别置于新配制的1％次氯酸钠溶液中，消毒15min，取出后用蒸馏水冲洗5次，用吸水纸吸干,备用。 2.取小瓶6只编好号码，分别称取并记录10个有胚或无胚半粒种子的重量,按表加入各种溶液和材料，封口后于25℃下培养48小时（80rpm,如无条件，则必须经常摇动小瓶）。 实验步骤（2013） 3.制作标准曲线：以不同淀粉浓度（0-7μg/L）或淀粉量（0-100μg）及其吸光度绘制标准曲线。 4.α-淀粉酶提取:将培养后的材料研磨成匀浆,连同培养液一起加蒸馏水定容到10mL, 10000rpm离心10min。 5.β–淀粉酶灭活：吸取各管上清夜2mL，分别加入6支试管中,在70℃恒温水浴中加热12分钟，取出后迅速在自来水中冷却。 6.α-淀粉酶活性分析：另取第7支试管,向其中加2mL蒸馏水;然后分别向每管(共7支)加入1mL淀粉磷酸盐的溶液，摇匀，在30℃温箱或水浴中保温20min，然后加I2-KI溶液1mL，混匀，加蒸馏水5mL稀释，混匀，以蒸馏水为空白对照，于波长580nm下测定吸光度。 实验步骤（2015） 3.制作标准曲线：以不同淀粉浓度（0-7μg/L）或淀粉量（0-100μg）及其吸光度绘制标准曲线。 4.α-淀粉酶活性分析:吸取培养后材料的上清夜1mL, 分别加入6支试管中；另取第7支试管,向其中加1mL蒸馏水;然后分别向每管(共7支)加入1mL淀粉磷酸盐的溶液，摇匀，在30℃温箱或水浴中保温20min，然后加I2-KI溶液1mL，混匀，加蒸馏水5mL稀释，混匀，以蒸馏水为空白对照，于波长580nm下测定吸光度。 实验结果计算 1. 依回归方程计算各管淀粉量 Y=21.889A+0.1321 2. 第7瓶为淀粉的原始量（Y1）。 3. 第2-6瓶分别为反应后淀粉的剩余量（Yx）。 注意事项 1.足够的培养诱导时间，预防长菌； 2.酶充分释放； 3.β–淀粉酶灭活； 4.酶量及底物用量的调整。 实验报告（作业） 计算实验结果。 分析并解释赤霉素对α-淀粉酶的诱导效果。 对本实验有何改进意见。 * 胚 GA GA GA α- amylase α- amylase α- amylase β - amylase 都作用于α-1,4糖苷键，产物都是麦芽糖 相同点 广泛存在 存在于萌发种子中 5 耐酸、不耐高温 耐高温、不耐酸 4 糊精分子量大（极限糊精） 产物糊精分子量小 3 端解酶（非还原端两两相切） 内切酶（随机切） 2 不能跨越分枝点 可跨越分枝点 1 不同点 β-淀粉酶 α-淀粉酶 无胚半粒 0 1 1.5 2.5 2×10-7 6 无胚半粒 0 1 1.5 2.5 2×10-6 5 无胚半粒 0 1 1.5 2.5 2×10-5 4 无胚半粒 0 1 1.5 2.5 2×10-4 3 无胚半粒 2.5 1 1.5 0 0 2 有胚半粒