第七章植物原生质体培养与细胞融合2014年.pptVIP

1. 说明原生质体分离的两种方法 --- 机械法和酶法的特点。 2. 原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？ 3. 简述原生质体3种培养方法及特点。 4. 原生质体融合有哪几种方法？ 5. 杂种细胞及植株筛选方法。 思考题 2种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体混合在液体培养基中一起培养。用于某些物种原生质体或杂种细胞的培养。条件2个物种原生质体间能发生有效的互馈；其产生的愈伤组织形态上能彼此区分。 2）共培养法 3）Cuprak微滴法 高国楠（1977）及Gleba（1978） 设计特别培养皿培养单个原生质体及其再生的细胞。 两室 大的内室：很多小穴，加入原生质体悬浮液（0.25-0.5μl）； 小的外室：注入无菌水，保持培养皿内湿度。 可进行单个原生质体培养。 六、细胞壁的形成 培养2-4天，原生质体失去其特有的球型外观，这是再生新壁的象征。 研究认为， 旋花科植物原生质体只有在外源供应一种易于代谢的碳源（蔗糖）时， 细胞壁才能再生。 培养基中若存在电解质渗透压调节剂时会抑制壁的再生。 壁的形成与细胞分裂有直接关系， 凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。 愈伤组织形成后，转入不含渗透压调节剂的培养剂中， 其培养及植株再生与一般组织培养方法相同。 原生质体培养的程序 一、原生质体融合意义原生质体融合也称体细胞杂交，即，分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下互相融合成一体。 自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。 第三节 原生质体融合 原生质体融合 ◆打破了种间界限（生殖隔离），使基因交流扩大范围； ◆克服有性杂交特别是远缘杂交的不亲和性； ◆扩大了遗传变异及种质资源的范围。 原生质体融合的意义 甘薯 原生质体融合植株 1. 化学法融合 1）无机盐诱导融合 1909年，Kuster证实， 低渗NaNO3处理 可诱导发生质壁分离表皮细胞2个原生质体融合。 缺点 异核体形成频率不高， 尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。 二、原生质体融合方法 Carlson等（1972） 获得第一个体细胞杂种 2）高pH-高钙离子诱导融合 Keller 和Melcher（1973年） 强碱性的高浓度钙离子 （pH，10.5；钙离子，50mmol/L） 37℃处理30min， 两个品系烟草叶肉原生质体很容易融合。 1977年，获得烟草种间和种内体细胞杂种。 对矮牵牛效果也很好， 但对有些物种， 高pH可能有毒。 高国楠等（1974）提出，现被广泛采用。滴150μl混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层;吸取PEG融合诱导液（28-58%，分子量1500-6000）450μl，使其逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连；培养基进行清洗。高Ca2+-高pH溶液清洗，可提高原生质体融合频率。 3）聚乙二醇（PEG）诱导融合 优点 ▲采用聚乙二醇作为融合剂时， 异核体形成的频率很高，可重复性很强； ▲对大多数细胞类型来说毒性很低； 洋葱 烟草 将原生质体悬浮液离心，去上清， 用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁）悬浮， 置于融合小室； 在电融合仪的交变电场作用下，原生质体彼此靠近， 紧密接触，在两极间排成串珠状。 给予瞬间的高强度电脉冲，质膜发生可逆性电激穿，导致融合。 电融合法的优点（与化学融合法相比） ▲简单、迅速、效率高； ▲经融合处理后没有中毒反应； ▲需要特殊设备，不常采用。 2. 物理法融合（电融合技术） 德国农业科学院培育 枝头上开花、结出鲜红的番茄， 而地下块茎却是马铃薯。 番茄马铃薯 德国汉堡大学 把牛肉细胞和番茄细胞融合成杂交种细胞， 繁殖出一种杂交新品种。 ▲内含牛肉动物蛋白和番茄植物蛋白各半； ▲蛋白质总量为普通番茄的40倍； ▲所结出的果实 兼有牛肉味和番茄味，营养也较全面。 牛肉番茄 ◆对称融合 完整原生质体融合，产生核－核、胞质－胞质重组的对称杂种。 常因分裂不同步使一方的染色体全部或部分丢失。 ◆不对称融合 使一方的细胞核失活（胞质体） 或同时也使另一方的胞质失活（核质体），产生不对称杂种。 ◆微原生质体融合 只有一条或几条染色体的微核与原生质体融合。 原生质体融合类型 ◆胞壁再生 比原生质体培养稍滞后。 ◆核融合 异核体、同核体及多核体的混合群体。 异核体双核分裂同步—— 子细胞含双亲的遗传物质； 不同步—— 一方