《酶工程》第4章固定化酶和细胞.ppt

微囊化法制备固定化酶有两种方法 ① 界面沉淀法 一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 ② 界面聚合法 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。 4.3 固定化酶方法研究热点 热处理法 结晶法 纳米材料酶固定法 4.3 4.4 微生物、植物和动物细胞固定化 细胞特性比较 细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞 细胞大小/um 20-300 1-10 10-100 倍增时间/h 12 0.3-6 15 营养要求 简单 简单 复杂 光照要求 大多数要光照 不要求 不要求 对剪切力 敏感 大多数不敏感 敏感 主要产物 色素、药物、香精、酶等 醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶 疫苗、激素、 抗体、酶 固定化细胞的使用范围 类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。 固定化细胞的特点 保持了细胞的完整结构和构象 保持了原有酶系及代谢体系 发酵稳定性好，可反复使用 细胞密度提高，提高产率 提高固定化工程菌的质粒稳定性 概念 定义： 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞. 该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 细胞固定化方法 吸附法 包埋法 吸附法 它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 同种微生物可用多种吸附剂，同种吸附剂可吸附多种微生物，包括硅藻土、多孔陶瓷和塑料等 条件温和、简便、载体可再生、吸附力弱 应用 酵母细胞：多孔陶瓷-酒精和啤酒 活性污泥：硅藻土、多孔材料—有机废水 霉菌：多孔塑料—酶和有机酸 植物细胞：中空纤维—色素、香精及药物 动物细胞：微载体—疫苗及重要的酶 包埋固定法 包埋法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。 包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 包埋法分类 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺。 举例海藻酸钙包埋法 ： 基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞。 固定化细胞的优缺点 优越性： 固定化细胞保留了胞内原有的多酶系统； 固定化细胞保留了胞内酶系的原始状态与天然环境； 局限性： 仅能用于产生胞外酶的菌体； 具有扩散限制； 使用初期会有细胞组分渗出，影响产品质量； 若底物是高分子物质或不溶性物质，使用时会很麻烦。 4.5 固定化原生质体和辅酶 原生质体的制备 固定化方法 辅酶固定化 原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分离——得到原生质体 酶的选择 细菌——溶菌酶（肽多糖） 酵母——葡聚糖酶（葡聚糖） 霉菌——几丁质酶、纤维素酶 植物细胞——纤维素及果胶酶 原生质体固定化的方法 将原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。 凝胶包埋法：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶等 固定化原生质体的特点 增加通透性、提高产率 保持原有新陈代谢特性 提高稳定性、反复使用 易于产物分离、提高质量 添加渗透压稳定剂 辅酶固定化 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生 辅酶固定化的方法 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 间隔臂 辅酶固定化的形式： 4.6 固定化酶（细胞）的应用 固定化酶和细胞的应用 工农业 医药 分析化学与酶电极 环境保护、能源开发、基础理论研究 1.固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用 氨基酰化酶——第一种固定化酶（离子键结合） 葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。（放线菌热