《酶工程》第5章酶的分子修饰.ppt

活化方法 PEG均三嗪衍生物：氨基修饰 PEG琥珀酰亚胺衍生物：氨基修饰 PEG马来酸酐衍生物：氨基修饰 PEG胺类衍生物：羰基修饰 作用 了解酶分子构象 侧链基团的作用及对酶的影响 测定某一基团在酶分子中数量 提高酶的催化活性、增强稳定性降低抗原性 获得自然界中不存在的新酶 酶分子的侧链基团修饰总结 基因家族重排技术 从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程 与DNA重排技术不同点：从基因家族的同源基因出发 头孢菌素C酶的活性显著提高 突变基因文库的构建 质量要求：文库的包容性、完整性 主要过程： 载体选择：质粒、噬菌体DNA、黏粒 基因重组：黏末端、平末端、修饰末端 文库形成：转化 定向进化的选择策略 1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 3、高通量的筛选体系 定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 酶检测 信号探测 分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁 定向进化技术 Fig. 1. Publication rate of the ‘directed evolution’ articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words ‘directed evolution’ in their titles. 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR 在60％二甲基亚砜活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组 抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物活性 易错PCR 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 底物特异性 基因理疗 交错延伸 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组 活力增加66倍底物特异性增加1000倍 大肠杆菌 定向进化的应用 回本章目录 5.6 酶分子化学修饰的应用 在酶学研究方面的应用： (1) 酶的活性中心研究; (2) 酶的空间结构研究; (3) 酶的作用机制研究; (4) 确定氨基酸残基的功能； (5) 测定酶分子中某些氨基酸的数量。 (1)降低或者消除酶抗原性： PEG-精氨酸酶消除抗原性 (2)增强医药用酶的稳定性： PEG-SOD半衰期延长35倍 在医药方面的应用 (1)提高工业用酶的活力： (2)增强工业用酶的稳定性： (3)改变酶的动力学特性： 在工业方面的应用 小 结 知识点: 酶分子化学修饰的原理与方法 学习要求： 1、掌握分子化学修饰的原理； 2、了解酶分子化学修饰的方法。 复习题： 1、酶化学修饰的方法及优缺点？ 2、修饰反应的影响因素？ * 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。 * 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。 蛋白类酶的侧链: 组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲