兽医药理学实验-17-2精品文档.pptVIP

抗菌药物最小抑菌浓度（ MIC ）的测定 兽医学院实验教学中心 1. 掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物 MIC 的基本步骤，能准确测出各种抗菌药物的 MIC 值，了解单药的抗菌活性； 2. 为后面棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘法 的中心浓度。 实验目的 1 最小抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ， MIC ）： 药物在培养基中通 过连续两倍稀释，眼观可见待检测细菌在培 养基中生长受到抑制的最低浓度即为该药的 最小抑菌浓度。 实验原理 2 实验材料 ３ 【实验药品及菌株】 1. 药品 氨苄西林（中国药品生物制品检定所，含量： 86 ％） 阿米卡星（齐鲁制药有限公司， 效价： 650u/mg ） 四环素（中国药品生物制品检定所，含量： 95% ） 粘菌素（中国药品生物制品检定所，含量： 99.5 ％） 实验材料 ３ 【实验药品及菌株】 2. 培养基 MH 营养肉汤、 LB 营养肉汤、麦康凯琼脂 生理盐水 3. 菌株 大肠杆菌标准菌株 ATCC25922 ，由中国兽 医药品监察所提供。 【实验器材】 96 孔细胞培养板、移液枪 1mL 、200μl 各 一支、枪头 1mL 、200μl、小试管、锥形瓶 、试管架、酒精灯、平皿、酒精棉 ; 分析天平、自动高压灭菌锅、超净工作台、 37℃恒温培养箱。 实验材料 ３ 1. 在 96 孔板的前三排即 A/B/C 三排每孔中各 加入空白肉汤 100μL 实验步骤 ４ 空白肉汤 100μl 药液 100μl 空白肉汤 100μl 空白肉汤 100μl 空白肉汤 100μl 空白肉汤 100μl 取 100μl 弃去 100μl 2. 在 A/B/C 三排的第 1 孔加配好的药液 ( 浓度为 512 单 位 /mL 或 μg/mL)100μl ，然后对药物进行二倍稀释。 此时每孔药物浓度从左到右依次为 ( 单位 :IU/mL 或 μg/mL) ： 256 ， 128 ， 64 ， 32 ， 16 ， 8 ， 4 ， 2 ， 1 ， 0.5 ， 0.25 ， 0.125 3. 再在每一孔中加入稀释好的菌液 100μl, 这样 就形成测定一个药物 MIC 值的三次重复（ A/B/C 三排样品）。此时每孔药物浓度即最 终药物浓度从左到右依次为 ( 浓度 : 单位 /mL 或 μ g/mL) ： 128 ， 64 ， 32 ， 16 ， 8 ， 4 ， 2 ， 1 ， 0.5 ， 0.25 ， 0.125 ， 0.06 4. 另外在同一块板上做一排阴性对照（仅加 空白肉汤不加菌液）和一排阳性对照（加 菌液肉汤不加药液）； 5. 将 96 孔板放入 37 ℃ 恒温培养箱培养 16~20 小时后，观察结果。 操作完成后放于培养箱中培养 16-24 小时 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A ① 100μ L 肉汤 ② 100μ L 药物 最后加 100μ L 菌液 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L 100μ L B 同 A C 同 A D 步骤同 A ， 更换药物 E 同 D F 同 D G 阳性对照 100μ L 肉汤 +100μ L 菌液 H 阴性对照 200μ L 肉汤 1. 无菌操作 ① 所有用具都需经过灭菌处理。 ② 超净台使用前后都需用新洁尔灭擦拭，开紫外 灯进行消毒； 不能拿酒精棉球擦挡板 。 ③ 操作前，用酒精棉球擦手。 ④ 每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过； 移液 枪和枪头不准在酒精灯上烤 ！ ⑤ 操作过程中尽可能不将 96 孔板盖完全打开 。 注意事项 5 2. 移液器的使用 ① 调刻度。 ② 不倒立。 ③ 准确吸取液体。 ④ 换枪头。 3 、其他注意事项 ① 培养板上做好标记 （班级、姓名、时间、药物名称及 浓度） 。 ② 每药做三个重复，每个板做一个阴性对照和一个阳性 对照。 ③ 超净台内用过的不需要的东西都必须放到废液缸内。 ④ 实验完后要收拾好台面。 注意事项 5