四种乳酸菌中央碳代谢的通量差异特性研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 乳酸菌在自然界中分布广泛，其发酵代谢的最终产物包括多种有机酸（乳酸、乙酸、 甲酸）和乙醇等。乳酸菌及其代谢产物在食品行业有着非常广泛的应用，如发酵乳制品、 肉制品、泡菜、酒类等生产中重要的风味物质和发酵剂。本文通过发酵实验、生物信息 数据库查询等研究手段，构建了四种乳酸菌的代谢网络模型，通过乳酸菌发酵有机酸经 典数据并运用代谢通量分析方法，比较了不同乳酸菌的代谢特性。研究成果如下： 本文对德氏保加利亚乳杆菌（Lb.1.2717 ）、嗜热链球菌（St.1.2718 ）、植物乳杆菌 （Lp.1.246 ）以及面包乳杆菌 （Lp.1.3924 ）进行发酵实验测定其OD (600nm)及pH 值，以 此对其生长曲线和产酸能力进行研究，结果发现，Lb.1.2717 、St.1.2718 和Lp.1.246 在8-28h 进入对数生长期后，此时菌株活力较好，繁殖能力强，产酸性能好。Lp.1.3924 在 4-12h 进入对数生长期后，此时菌株繁殖旺盛，活力较好，并且产酸性能好。四种乳酸菌在相 同培养条件下OD600nm 值和pH 值变化规律不同，Lp.1.3924 延滞期较短，先进入对数生 长期，因此其pH 值首先下降，但进入对数期后，Lp.1.246 增值速率最快，但pH 值最小 的是Lb.1.2717 和St.1.2718 。 通过UPLC 、LC-MS/MS 以及HPLC 对四种乳酸菌的上清菌液进行测定，采用色谱 柱为Agilent Diamonsil C18(2) (250*4.6 mm, 5μm) ，流动相为0.1%磷酸水：甲醇=95 ：5， 等度洗脱，检测波长为210 nm ，流速为1mL/min，柱温为30℃。在设定的浓度范围内线 性拟合良好，相关系数 0.992220~0.999061，通过对上清发酵菌液的有机酸谱峰的保留时 间与有机酸标准品谱峰进行对比分析，确定了其中有机酸的种类为乳酸、苹果酸、延胡 索酸、α-酮戊二酸、琥珀酸以及柠檬酸，并测定出6 种有机酸的含量。 通过KEGG 数据库和BRENDA 综合酶信息系统对四种乳酸菌中央碳代谢网络信息 进行提取，在分析了胞内糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径等途径之后，运用 MetaFluxNet 软件构建了四种乳酸菌的中央碳代谢网络模型。 以中央碳代谢网络模型为基础，分别建立了 Lb.1.2717 、St.1.2718 、Lp.1.246 以及 Lp.1.3924 以葡萄糖为唯一碳源的代谢通量分布图，运用代谢通量分析对四种乳酸菌的代 谢通量分布情况就行了比较，在假定不同乳酸菌的代谢终产物通量一致的情况下，分别 讨论了代谢通量在糖酵解途径、三羧酸循环途径以及磷酸戊糖途径中的通量分布特点， 依此判断出代谢网络中关键性节点为g6p ，f6p ，pep ，pyr ，oxa 和 akg 。通过建立了 固定除乳酸外所有代谢产物浓度的代谢通量分布图，得出乳酸生成量上产生了较大的变 化，其中Lb.1.2717 产生乳酸量最多，分别是St.1.2718 、Lb.1.246 和Lp.1.3924 的118%、 128%和120% 。相对于St.1.2718 、Lp .1.246 和Lp.1.3924 三种菌株增幅分别为18.9%、27.5% 、 20.3% 。进一步分析对比了四种乳酸菌的代谢特性差异，依此得出乳酸的产量与该乳酸菌 的OD 值成反比。 关键词： 乳酸菌；代谢产物；代谢网络模型；代谢通量分析；关键性节点 -I- 哈尔滨商业大学硕士学位论文 Abstract Lactic acid bacteria are widely distributed in nature, and the metabolic products of its fermentation include various organic acids (lactic acid, acetic acid,