DAIa2GIP抑制软骨细胞线粒体凋亡的机制研究.pdf

目 录 中文摘要I AbstractⅤ 常用缩写词中英文对照表Ⅹ 前 言1 1 材料与方法3 1.1 主要实验仪器3 1.2 主要实验试剂3 1.3 实验细胞及分组4 1.4 实验方法4 1.5 统计学方法7 2 结 果 8 2.1软骨细胞鉴定结果8 2.2 线粒体膜电位检测及Annexin-V FITC kit （磷脂酰丝氨酸外翻分析）细胞 凋亡检测结果8 2.3激光共聚焦显微镜下细胞钙超载测定结果12 2.4 ELISA法测细胞色素C含量结果13 2.5 Western Blot法测P53及Bcl-2含量结果13 3 讨 论14 4 结 论17 参考文献18 综 述20 致 谢31 个人简介32 山西医科大学 （博）硕士学位论文 DAIa2GIP 抑制软骨细胞线粒体凋亡的机制研究 摘 要 目的： 1.观察DAIa2GIP拮抗IL-1β诱发软骨细胞线粒体凋亡的效应； 2.探讨DAIa2GIP拮抗软骨细胞损伤的分子机制； 3.为骨关节炎药物治疗提供新的思路，寻找新的突破，同时为骨关节炎的转化医 学研究提供实验依据。 方法： 本实验选取SD大鼠出生7 日幼鼠的肋软骨细胞，仔细分离消化后用含1％双抗、 10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，制作细胞爬片利用免疫组化法进行细胞鉴 定，选取培养的第三代细胞进行实验。将细胞在上述培养基基础上不同处理后分为 6组，具体为：①正常对照组：原培养基基础上不添加其他药物；②IL-1β诱导组： 加入IL-1β（10 ng／mL） ；③IL-1β+DAla2GIP孵育组：加入 IL-1β（10 ng／ mL）、DAla2GIP （100pM）；④IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP (GIPR拮抗剂)孵育组： 加入IL-1β（10ng／mL）、DAla2GIP （100pM）、pro3GIP （100pM）；⑤DAla2GIP 孵育组：加入DAla2GIP （100pM）；⑥pro3GIP孵育组：加入pro3GIP （100pM ）。 在相同环境下孵育48h后，各组细胞进行线粒体膜电位检测、Annexin-V FITC kit （磷脂酰丝氨酸外翻分析）细胞凋亡检测、激光共聚焦显微镜细胞钙超载测定、 ELISA法测定细胞色素C含量及Western Blot法检测P53、Bcl-2含量。 结果： 1. SABC免疫组织化学法鉴定所提取细胞为软骨细胞，细胞生长良好，密集区域细 胞多呈现圆形，稀疏区域细胞多呈多角形。取第三代细胞进行后续实验。 I 山西医科大学 （博）硕士学位论文 2.线粒体膜电位及Annexin-V FITC kit （磷脂酰丝氨酸外翻分析）细胞凋亡检测： ①软骨细胞线粒体膜电位保持程度 （流式细胞学）：IL-1β+DAla2GIP孵育组 （93.15%±0.07%）明显高于IL-1β诱导组 （81.00%±1.48%） （P0.01）；IL-1 β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+ pro3GIP孵育组 （81.65%±2.26%）无明显统计学差 异 （P0.05），且两组均低于正常对照组 （95.10%±0.42%） （P0.01）；正常对 照组、DAla2GIP孵育组 （94.95%±0.49%）及pro3GIP孵育组 （92.95%±0.35%）均 无明显统计学差异 （P0.05）。 ②软骨细胞线粒体膜电位保持程度 （荧光显微镜）：IL-1β+DAla2GIP孵育组 （93.36%±2.34%）明显高于IL-1β诱导组 （89.86%±1.76%）；IL-1β诱导组与 IL-1β+DAla2GIP+ pro3GIP孵育组 （89.07%±1.40%）无明显统计学差异，且两组 均低于正常对照组 （95.43%±1.31%） （P0.01）；正常对照组、DAla2GIP 孵育组 （93.9%±2.28%）及pro3GIP孵育组（93.5%±1.56%）均无明显统计学差异（P0.