绿色荧光蛋白技在细胞生物学研究中应用.pptVIP

绿色荧光蛋白(GFP)技术在 细胞生物学研究中的应用 荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞 亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可 以发出荧光:刺胞亚 物多发射绿色荧光,而栉水母 类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白( green fluorescent protein),简称GFP,它的发现和应用被称为细胞生物学 次革命。这种蛋白质结构很特殊,在受到蓝光或紫 外线刺激时可以发射绿色荧光,并不需要任何协同因子 底物,适合用作普遍的报告标记,尤其适合于活体细胞或 组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应 不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专 性,检测简单 果真实可靠,是一种独特的报告蛋白 Reporter protein 可广泛用于基因的表达 蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。 图1绿色荧光蛋白 1962年 Shimomura和] ohnson等人[1]首先从一种水母 类动物 Aequorea Victori 14年M. Chalfie[3 其 成功地在原核和真核生物中得到表达。90 P的性质和应用进行 的研 用的研 现代生物学研究的一个精 植物学、动物学、微生物 们对GFP发光机制研究的深入,通过对其 GFP突变型,有的发蓝光或黄光而不是绿光 的发出 度的限制[5 达。这些突变体极 地拓宽了GFP的应 使GFI 生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前 GFP的结构 图2绿色荧光蛋白结构 GFP编码238个氨基酸的多肽单体,只有完整的GFP分子 生物荧光,被切断的GFP(即使是C、N未端的少 数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力[6]。与荧光 的产生直接 是GFP分子中一小段被称为荧光生色团 Chromophore)的部位[7]。在GFP的初级氨基酸序列 第65~67 酸(Ser-Tyr-Gty)形成环状三肽, 以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连 引的形成不受 种属的限制,其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过 自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定,不易变 用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是 pH值恢复到中性或者移去变性物时,它的荧光又会恢 复到变性前的水平。GFP的生色团之间是通过共价键结 合。生色团形成的机理目前尚不清楚,但在有分子氧存在 的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽 这可能是形成色基的必然过程。[8 GFP的应用特点 1易于检测 GFP荧光反应不需外加任何反应底物,酶或其它共反应因 子,也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题,只需 紫外光或蓝光激发,即可发出绿色荧光,GFP发射的荧光 用肉眼或荧光显微镜就可以检测到。灵敏度高,对于单细 胞水平的表达也可识别,同时还可利用其进行定量检测 由于GFP对活细胞基本无毒害,因此无须特殊处理就可以 很方便地进行活体观察 不同光谱特性的GFP 突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或 启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析 诊断等研究。这就使GFP有可能成为一种快速、简便、经 济的标记蛋白,GFP基因作为报道基因可能有广泛的用途。 2荧光稳定 ■GFP无光漂白现象,在很大的pH范围内(pH7 12)都可以正常发出荧光,受温度的影响也很小 只有在超过65℃时才会变性,荧光消失。荧光显 微镜强光照射下,GFP抗光漂白 ( Photobleaching)能力比荧光素( fluorescein) 强[9]。特别在450490nm蓝光波长下更稳定 但在340~390nm或395~440nm范围内,仍 会发生光漂白现象。对于长时间光照,GFP也有 很好的耐受性,根据 Sheen等的研究,GFP在受 体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光 3广谱性 首先表现在它的表达几乎不受种属范围的 限制,在微生物、植物、动物中都获得了 成功的表达;其次就是没有细胞种类和位 置的限制,在各个部位都可以表达,发出 荧光。 4易于载体构建 由于GFP较小,只含有238个氨基酸,编 码GFP的基因序列也较短,约2.6kb,所 以它可以很方便地同其它序列一起构建多 种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频 率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中 表达很弱,但可通过更换GFP生色团氨基酸、 改变碱基组分、除去内含子、更换强启动 子等方法加强表达。 Connack等筛选出 种含Ser65突变的突变体,在大肠杆菌 中表达时,荧光强度比野生型高约100倍。