《发酵工程》第2章菌种选育.ppt

②、得到多种类型的重组子 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，得到多种类型的重组子。 参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。 ③ 、重组频率特别高。 因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组频率可达到20％。 ④ 、可以和其他育种方法相结合。 把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。 ⑤ 、可提高筛选效率。 可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样可提高筛选效率。 （二） 原生质体融合的一般步骤 原生质体融合方法： PEG促溶、电诱导促融、脂质体(liposome) 融合。 ① 、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，可能得到高产变异菌株。 例1：生二素链霉菌通过原生质体再生使螺旋霉素产量提高2倍。 例2：弗氏链霉菌通过再生使泰乐菌素生产能力提高了3倍多。 （三） 原生质体融合在微生物育种中的应用 ② 、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常引起质粒消除，导致染色体或次级代谢途径变化，可能出现高产变异株。 质粒消除频率达13％～85％， ③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。 ④、 有效的种间融合，可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发“沉默基因”的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。 概念：按人的意志，将供体遗传信息在体外与载体相接成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使其在受体中表达和遗传。 六、 DNA重组技术 （DNA recombination technology） 工业应用举例： 将血红蛋白基因引入顶头孢霉菌中，限氧条件下头孢菌素C的产量提高了5倍； 将麦迪霉素产生菌的4’-羟基酰化酶基因克隆到生二素链霉菌内，可直接产生酰化螺旋霉素。 医药应用举例： ①、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞生成素(EPO)、重组链激酶和集落生长因子等。 ②、基因工程抗体，极大地拓展了抗体的功能及其临床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。 ③、转基因动物，生产一些需要量大或Pr复杂需要翻译后修饰的重组蛋白. 分子育种方面应用举例： ① 、增加生物合成基因量，增加抗生素产量； ② 、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量； ③ 、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体内产生杂交抗生素； ④、 激活沉默基因，产生新的生物活性物质或提高抗生素产量； ⑤ 、把异源基因克隆到宿主中表达，改变生产工艺。 （一） DNA重组技术基本过程 DNA重组操作步骤： ①、 含目的基因的DNA片段的准备； ②、 载体； ③ 、含目的基因的DNA片段与载体相连接； ④ 、将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增； ⑤ 、筛选出带有重组DNA分子的转化细胞； ⑥ 、鉴定外源基因的表达产物。 常用获得目的基因的方法： （1）鸟枪法（Shotgun Cloning） 限制性内切酶在特定部位切开DNA双链，如选用合适的酶，就可能获得含有目的基因的DNA片段，与用产生同样末端的酶打开的载体DNA环相连接，就可进一步分析研究。该法常用于建立基因文库（Gene Library）和原核生物基因的克隆。 1、 目的基因的准备 异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。 异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系，能长出各种类型的分离子。 但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生（图2-4）。 （4）重组体的形成 链霉菌基因重组主要过程： 常用放线菌杂交方法： 2、 放线菌杂交技术 混合培养法 平板杂交法 玻璃纸转移法 a 、选择性平板法 两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即为重组体。 （1）混合培养法 b 、异核系分析法 混合培养后所制得