《发酵工程》第6章连续培养操作技术.ppt

二、实验设计与操作1. 实验的设计与操作原则 在设计一个长期运转的连续培养系统时，必须要注意到，由于选择压力的存在有可能使菌体产生自发性突变。具有竞争优势的菌体迟早会战胜反应器中的原始菌株。因此在研究均一细胞群体生理特性的过程中，为了研究细胞对环境条件变化的反应和由于突变所导致的基因变化，一次培养的时间不应过长。 （1）实验的设计 在培养时间过长(例如：对于肠杆菌来讲，大约为2~3周)时，一些培养物会在代谢压力(例如：底物过量、生长因子的限制、产物抑制等)下产生聚集或产生强烈的贴壁生长。 当对在这种情况下获得的数据进行分析时应该加以注意。对于这些类型的培养来讲，也应对操作时间进行限制。 如果计划进行长时期操作，应该考虑到，对管道(由于泵送和酸、碱溶液的作用产生破坏)和加工中所用到的气体输入和流出管道进行必要的替换。 对培养基进行设计的基础是，用于细胞生长和产物合成所需要的营养物质，除了含有平衡生长所必需的所有组分或那些有可能对菌体的生长动力学和产物形成产生干扰的营养物质以外，还应在连续培养中建立起营养物质的适当浓度。特别是，要对某种生长因子进行限制时更要如此。随着新型生物技术(如重组DNA)在高价值产物的生产过程中变得越来越重要，化学合成培养和适应进料方式的应用也越来越广泛。对于这些目的来讲化学计量学和代谢调控的思路是特别重要的。 （2）培养基的配制 为了避免沉淀物的产生，应该考虑到培养基的稳定性和营养物质间的相互作用。 培养基中组分产生沉淀的原因可能是，高浓度的金属离子(如铁、钙、镁等离子)、高压灭菌过程中的高温以及高pH。这会导致金属离子和一些其他痕量元素的损失以及对细胞的生长和产物的形成产生不良影响。 为了获得较高的细胞浓度，应该对金属离子和痕量元素进行仔细控制(或减少)。EDTA和柠檬酸之类鳌合剂的使用，特别是与其他方法结合使用，可以有效地减少沉淀的产生。 正确地选择金属离子也是很重要的，因为那些与磷酸盐和镁离子相关的不溶性盐的形成通常也会带来一定的问题。 连续培养系统的灭菌比分批培养系统更为复杂，因为它需要更多和更大的贮液槽来贮存喂料培养基和酸、碱溶液，而且在操作过程中需要对其进行重新填充和替换(图6·5)。 （3）培养基和设备的灭菌 培养基中的一些组分或酸、碱溶液需要进行灭菌。 与各种贮液槽连接的输送管道和与反应器连接的肉汤容器会成为污染源，因此应该对其进行灭菌处理，并进行仔细连接。应在无菌环境下进行连接操作，例如，如果反应器系统较小，则要在干净的操作台上进行连接。 当反应器的体积大于5L时需要进行原位灭菌。可以用121℃的湿蒸汽进行原位灭菌。可将蒸汽通过双层或反应器内部的热交换器对设备进行间接灭菌,也可将蒸汽直接通人反应器中进行直接灭菌。直接通入蒸汽是比较快速和容易的操作方法，但是，由于蒸汽的冷凝作用会使培养基的体积增大10%~15%。 大型反应器的管道系统一般用蒸汽进行原位灭菌。管道系统应该尽量地短、直,并呈一定坡度向下走向,从而保证蒸汽及冷凝蒸汽在重力的作用下顺利流出。应该尽量避免T形连接。 为了将污染减少到最低程度,所有与反应器的无菌操作部分连接的管道都应该进行焊接处理,而不应有可以拆卸的连接部分。这是非常昂贵的,因此只用于特殊的加工过程(如细胞培养)。 在生物反应器的实际操作中需要用可以拆卸的连接方式，从而使反应器具有较高的灵活性。在这种情况下与灭菌设备相适应,所有的连接部分都应设计成凸缘形。为了避免尘土的积累,凸缘连接点处的管道交叉部分既不能减少也不能增加。最普遍的两种凸缘系统是所谓的快速连接夹环系统和螺丝系统。这些凸缘连接的共同特点是,通过O形环可以达到无菌连接。O形环是自动密封元件,其所用的全部密封压力随着系统压力的增大而增大。 连续培养过程中,温度、pH和溶解氧（PO2)的测定和控制方法与分批培养相似。然而,在连续培养过程中,pH和PO2有些在短期发酵过程是不常遇到的问题。由于生物膜的生长及蛋白质和其他物质在探测器顶部的吸附,会引起pH和PO2探测结果产生一定的偏移。然而可以通过改变培养系统的pH,并与非在线检测的测定结果进行对比,就可以对pH探针进行粗略校对。但是溶氧探针则不能进行如此校对。在任何时候只要可能,就应该用极谱仪溶氧探针。在自动清洗以后它比电流溶氧探针更为稳定,可用零点电极对其零点进行校对。.. （4）环境的控制 微生物的连续培养是以分批培养的方式开始的。在底物彻底消耗完之前,这种培养系统一般会在菌体指数生长期转换为连续培养。在系统发生转换以后培养系统的转运动力学特性会发生很大变化,其变化