石蜡切片免疫组化操作步骤.pdfVIP

石蜡切片免疫组织化学操作流程 一、 组 织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例） 1. 动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为 350mg/kg 动物体重，常用麻醉药 物浓度为 5%、6%、7%、10% （麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率 相应较高， 本人使用 7%浓度， 若注射位置正确， 约 3min 进入麻醉状态） ；动物麻醉后， 将其固定于灌流操作平台，仰卧位； 2. 动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑 突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈 膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心 脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位 于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入 升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血 管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高） ；固 定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接 将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意） 3. 动物灌流： C57 小鼠 25-30g 左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液 流出：吊瓶灌流——以生理盐水 50-100ml 快速冲洗血液，持续最好不要超过 5min （时 间过长会导致脑组织降解） ，待无明显血迹流出后换用 4%多聚甲醛进行灌流，约 100-150ml ，灌流速度不宜过快，约 10min ，固定液较充分的固定组织；注射器灌流—— 生理盐水 50ml 快速推注，后换用 4%多聚甲醛 50ml 缓慢推注。灌流成功的标志——灌 流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色； 换用 4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。 4. 开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域， 避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后， 应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况） 5. 脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组 织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前 约 2.5-3mm 切除前脑部分） 6. 固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于 4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过 18 小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失） ，一般控制在 12 小时以内 为宜 二、 组 织石蜡包埋 7. 组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记， 自来水流水冲洗约 10min ，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组 织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行 简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状， 无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片） 本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下： 自来水冲洗完成→ 50%乙醇 25min →70%乙醇 25min → 80%乙醇 25min →90%乙醇 25min →95%乙醇 I 10min →95%乙醇 II 15min →无水乙醇 I 10min →无水乙醇 II 15min →二甲 苯 I 15min →二甲苯 II 15min 8. 组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于 60 度烘箱内备用