《生物化学》教学课件：DNA Recombination20131128txw.pptVIP

2.3 整合和切离过程 ? 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） ? 整合位点---attB、attP 切除位点---attL、attR ? 依赖蛋白: 整合过程需要λ整合酶（integrase Int）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用。 切离反应需要噬菌体Xis基因的产物以及Int和IHF。 1) 整合酶(integrase) λ噬菌体int基因编码 功能：识别POP’和BOB’ 结合 与POP’结合 拓扑异构酶I活性 2)整合宿主因子（IHF) （integration host factor） 细菌基因编码 功能：促进整合酶与POP’和BOB’结合。 3)切除酶（excisonase） λ噬菌体xis基因编码 功能：与整合酶结合后识别POB’和BOP’,切割O序列，重新形成POP’和BOB’。 4)逆转刺激因子（FIS） 功能：参与切除过程。 溶源性细菌 (lysogen) 溶菌周期 （lysis） 原噬菌体 2.4 整合分子机制 ? 核心序列O全长15bp，富含A-T ? 发生在O内的重组交换位点相距 7bp。 ? 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同)。 ? attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力 -----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构。 ? Int结合： ----核心序列的反向位点（切割位置） ----结合在att臂上（臂与核心区靠近） attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力； 两序列的同源性在链交换时为重要因素。 Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分； 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交。 复习题 名词解释 同源重组 位点专一性重组 Holliday 结构 问答题 遗传重组有几种重要的形式？ 同源重组的简单过程及Holliday结构形成的分子机制。 细菌同源重组涉及的主要酶系及各自在重组中的功能为何。 λDNA的整合与切除的分子机制（重组涉及的各要素及简单过程）。 位点特异性重组有需要短的同源顺序，此与同源重组有何不同？ λ-DNA的整合和切除 1，附着点（att位点）： attB 大肠杆菌附着点，含B,O,B’三种序列 attP λ-DNA附着点，含P,O,P’三种序列 2, 核心序列（O序列）： 15bp,在 attB和attP中完全相同 -GCTTTTTTATACTAA- -CGAAAAAATATGATT- 3，B，B’，P，P’的长短和核苷酸序列均不相同 * 所需条件----同源序列、双链间互补碱基配对、重组酶、异源双链区形成 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大 （相似或相同片段、碱基配对） * 细线期－－－两条姊妹染色单体形成 合线期（偶线期）－－－同源染色体配对 粗线期－－－配对完成后，染色体变短、变粗，结合紧密 双线期－－－染色体进一步收缩变短，同源染色体间有几个接触点－－－染色体交叉发生交换的证据 终变期－－－观察染色体最理想的时期 * a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性,其中，双链结合活性最终导致的也是 RecA 与单链的结合状态 * The natural migration rate of a holiday junction is relatively slow. In E. coli the proteins Ruv A and Ruv B act as ‘motors’ to drive the migration faster. - ATP dependent process * Λphage进入E.coli后整合到寄主染色体上以及从染色体上切除均 attP 含 POP’三序列240bp（－160～＋80） Sne－－－235bp（－152～＋82） * ? 核心序列O全长15bp，富含A-T无碱基倒转对称性 ? Int结合 ----核心序列的反向位点（在每条链的适当位置上切割） ----结合在att臂上（两位点同时结合使臂位点靠近核心区） 第五节 DNA重组