基因功能的研究方法回顾.pptVIP

虽然内含子移动的机制是共同的，但靶位点的序列和内含子编码区域之间并无同源性。据推测内含子有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的歧化。靶位点是在各种靶序列中最长的，对于核酸内切酶来说也是最特异的。结果内含子永久性地插入到单个的靶位点中，而且不插入基因组的任何其他地方，此就称为内含子归巢( intron homing)。 含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低等真核生物中都有所发现。由此产生一种游离的因子，其编码的功能涉及到RNA的剪接或者DNA分子之间的移动。与此相关的观点认为内含子编码区域中密码子的用法与外显子稍有不同。 0.0 * 在第Ⅱ类内含子中大部分开放读框都具有一个与反转录转座子相关的区域（除核酸内切酶编码区之外）。这种类型的内含子在低等真核生物和某些细菌中都有发现。反转录酶对于内含子来说是特异的，而且和归巢有关。反转录酶以初始mRNA为模板合成内含子的DNA拷贝，通过采用与反转录病毒相似的机制使内含子插入到靶位点中。和这种情况有关的此种类型的反转录转座子与失去LTRs的一组反转录子是相似的。在靶位点产生缺口，形成的3′-OH对于引发来说是需要的。 0.0 * 第Ⅱ类内含子归巢的例子与前面介绍的反转录转座子转座的机制相似，内切酶在靶位点的双链DNA上切一切口，在缺口上产生了3’末端为反转录酶提供了引物。内含子RNA为cDNA的合成提供了模板。由于此RNA含有内含子两侧的外显子的序列，所以此cDNA要比内含子本身长，它能跨越双链切口，结果是使内含子插入到靶位点。 0.0 * 将一种核糖核蛋白和DNA底物的一道温育在体内可产生移动系统。这个核糖核蛋白含有一个带有第II组内含子的RNA和它的蛋白产物。它具有核酸内切酶活性，在恰当的靶位点交错切割双链。核糖核蛋白的RNA和蛋白两种成份对于剪切都是需要的。在催化中二者可能都有作用。 0.0 * 可移动的内含子似乎是被插入到先前存在的基因中。它们可能进化为核内前体-mRNA内含子。具有自我剪切的能力的内含子显示了剪接进化的重要作用。例如它们能移动到核中并成为snRNA的祖先。 0.0 * 内含子归巢突变就是利用归巢特性，将它们插到大肠杆菌的质粒载体中，另外再将人类HIV病毒和CCR5基因靶位DNA构建到另一载体中。当这2类载体在大肠杆菌或人类体外培养细胞中相遇，内含子RNA可以逆剪切方式插入到HIV和CCR5 DNA靶位中，而且表现为某种随机性。当内含子反向插入基因内部时，由于不表达IEP，成为永久整合。当内含子插入方向与IEP转录方向一致时，内含子可以继续转移破坏其他位点。这一系统可望用于缺少同源重组系统生物的功能基因组研究。　 0.0 * 4．基因的超表达用于功能检测 基因功能的检测除了使其失活外还可让其过量表达，基因产物的不足与过量都会破坏这种平衡，表现生长与发育的异常。 基因的超表达有两种技术： 1. 增加基因的拷贝数； 2. 采用强启动子促使基因表达 0.0 * 5. 反义RNA 反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的加工与翻译，是原核细胞中基因表达的调控的一种方式。然而，许多实验证明，在真核细胞中亦存在反义RNA，但其功能尚未全部明了。 最近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将之导入细胞内，转录出反义RNA，即能抑制特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。 0.0 * 5.1 反义RNA的分类和作用机制 下表总结了原核细胞内天然存在的11种反义RNA。这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类。 Ⅰ类：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB类)。 0.0 * Ⅱ类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。 Ⅲ类：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。 0.0 * 0.0 * 5.2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA ticRNA是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAP mRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAP mRNA的模板DNA链的