融合基因荧光定量诊断试剂盒说明指导书.docVIP

PML/RARα融合基因荧光RT-PCR诊疗试剂盒 一、试剂盒采取荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因情况, 约有90%急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RARα融合基因。所以检测PML/RARα融合基因已成为诊疗急性早幼粒细胞白血病和诊疗后追踪残余白血病细胞关键依据。 二、试剂盒组成(20人份) RNA提取液 （20ml /瓶） 1瓶 Taq酶 （40μl /管） 1管 反应液I （165μl /管） 1管 定量标准品 （50μl /管） 8管 反应液II （165μl /管） 1管 DEPC H2O （500μl /管） 1管 反应液Ⅲ （350μl /管） 1管 去离子水 （1100μl /管） 1管 逆转录酶 （25μl /管） 1管 三、检测步骤 1．标本采集 抽取外周血5ml抗凝后密封送检，或3ml新鲜骨髓标本密封送检。 2．标本处理 将5ml抗凝外周血或3ml骨髓加入等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸收白细胞层于1.5ml离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入0.5ml RNA提取液，充足混匀。室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃静置2-3分钟，4℃ 12,000rpm离心15分钟， 离心后反应管分三层，底层为微黄色氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层体积通常为提取液体积60%。小心将上层水相转移至灭菌离心管中，加等体积异丙醇4℃静置10分钟，然后4℃，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，加入400μl 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃ 7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10分钟。(注： 75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供DEPC H2O）。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，测A 3．逆转录反应：取灭菌0.5ml离心管, 按以下要求配置逆转录体系 反应液I 逆转录酶 模板（RNA） DEPC H2O 总反应体积 6.5μl 1μl 2μg（或5μl） 7.5μl 20μl 反应条件：37℃水浴60分钟 4．第一步PCR扩增：取灭菌0.2ml PCR反应管, 按以下要求配置PCR体系 反应液II Taq酶 模板（cDNA） 去离子水 总反应体积 6.5μl 0.5μl 5μl 13μl 25μl 反应条件：94℃→4分钟预变性, 然后按94℃ 30秒→54℃ 30秒→72℃ 60秒 5．第二步PCR扩增：取灭菌0.2ml PCR反应管, 按以下要求配置实时定量PCR体系 反应液Ⅲ Taq酶 模板（PCR产物） 去离子水 总反应体积 14μl 1μl 5μl 30μl 50μl 注：每次试验取105、10６、10７、10８一组阳性标准品瞬时离心上机即可 反应条件：93℃→2分钟预变性, 然后按93℃ 45秒→55℃ 60秒, 6．结果分析条件设定和判定 反应结束后分析试验数据，仪器自动得出未知标本数值Ｍ。2μg RNA标本PML/RARα融合基因cDNA含量Ｂ＝４×Ｍ，最终计算结果按下列公式换算：A (拷贝数/μg总RNA) = B (拷贝数/μl cDNA) ÷ 样本RNAOD260值×5/6。 【适用仪器】 ABI Prism 7000，ABI 5700，DA7600 【 贮 藏 】 本试剂盒保留于－20℃ 【 使用期 】 6个月