抗生素作用新靶点的发掘策略.docVIP

作者：谢练武 李翔 欧阳永长 姜淑梅 秦岭 【摘要】 抗生素的大量使用和滥用所造成的细菌广泛的耐药性迫使科研人员要加速寻找结构新颖的抗生素。抗生素作用靶点的发掘对药物发现非常重要，本文综述了近几年来国际上运用基因组学、基因芯片等 现代 生物信息学技术，利用细菌体内的各种酶反应与理化特性，发掘抗生素传统作用新靶点如脂肪酸合成酶、非传统作用新靶点如双信号转导调控系统、群体感应器等的研究进展，这对新抗生素的发现具有一定的指导意义。 【关键词】 抗生素； 新靶点； 耐药性； 基因组学 1941年人类首次实现青霉素的 工业 生产，启动了抗生素应用的 历史 。随后30多年的研究先后发现了β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和多肽类、多烯类等几大类抗生素，并成功地应用于 治疗 各种病原微生物感染。 科学 界一度乐观地认为，持续不断地发现新抗生素药物将最终使人们彻底摆脱感染性疾病。然而，随后的40年，尽管药物研究的投入越来越大，却很少有新碳骨架化合物作为临床药物得以开发。近些年来，由于过度使用抗生素，特别是滥用抗生素，病原菌日益广泛的耐药性已成为药物治疗中越来越常见的问题［1～3］，人们迫切需要寻找新的抗生素药物。 为了克服细菌的耐药性，特别是多重耐药性问题，人们需要运用新的思路去发掘新的抗生素。20世纪90年代以来，随着基因组学、蛋白组学和生物信息学的迅猛 发展 ，人们获得了丰富的基因信息与数据，阐明了上千个蛋白新靶点。一些影响细菌生长和致病的关键基因的发现以及以此为靶点的相应筛选模型的构建是发现抗耐药细菌的新抗生素的关键。本文综述了近年来科学家们发掘抗生素作用新靶点所采取的方法、主要靶点类型和有关作用机制。 运用基因组学来开发抗生素新靶点 基因组学是为了阐明各种生物基因组中碱基对的序列信息，破译相关的遗传与功能而形成的一门基础学科。目前，国际上已经完成了人类、多种细菌等微生物、多种昆虫、多种啮齿类动物的全基因组序列测定工作。从致病与非致病微生物的基因组序列与功能研究中发掘抗生素的新靶标，是生物信息学、病原微生物学和药物化学等多学科综合、交叉的研究领域，有关研究不仅开辟了药物研究的新领域，也将为微生物及其活性产物的利用开辟新的研究热点。目前运用基因组学开发抗生素新靶点的主要研究方法概括如下。 寻找细菌致病开放阅读框 为成功研发新药，人们不断运用各种手段来筛选抗菌药物作用靶点［4］，一般首先考虑以下三个筛选标准：①运用生物信息学寻找所有潜在药物靶细菌体内保守的开放阅读框(orfs)；②发现一些只在原核细胞中出现，而不在真核细胞特别是高等真核细胞中出现的orfs；③运用药物靶细菌体内功能基因敲除技术来验证这些orfs是否决定了一个或多个病原菌的致病力。符合以上三个筛选标准的基因就是最佳的备选靶标基因。 rosamond等［5］通过30多个微生物基因组的生物信息学分析寻找到了多个药物作用靶点，这些靶点影响微生物的生存与繁殖，在病原菌中高度保守，而在人体内或者完全缺失，或者截然不同。他们将大肠埃希菌的4289个基因与七种呼吸道疾病致病菌(包括铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和肺炎链球菌等)的基因组进行比对，发现所有这些细菌中都有246个基因高度保守，其中68个基因人类缺失；经进一步比对发现，这68个基因中有34个功能未知，其中16个是非关键基因，另外18个则特别重要，包括喹诺酮和大环内酯抗生素的作用靶点。他们选择这18个基因中的3个作为靶点基因用于药物筛选，寻找治疗呼吸道疾病的新药，取得了很好的结果［5］。 确定关键基因的功能 采用各种遗传变异方法确定未知保守基因的功能，如热敏变异、碱基标记诱变、反义rna系统表达以及功能基因敲除等方法［6］，以及鉴定蛋白质性质，确定其是否具有用于药物筛选的潜力。 日本研究者从临床分离到耐甲氧西林金葡菌(mrsa)和耐万古霉素金葡菌mu50(vrsa)［7］，它们有70多个代表基因(总共2600个基因)与新的毒性因子有关，这些毒性因子能增强耐药菌株对人的致病力，当然也是更为广泛的潜在抗生素靶点。 阐明关键基因产物的功能 有研究者采用高通量基因组结构分析方法［8］阐明蛋白质x衍射结构，根据结构将它们进行分类，在一级结构基础上进行折叠，考察二级结构，并预测三级结构与功能。也有人使用细菌基因芯片或基因表达图谱［9］，评价不同条件下的mrnas表达水平。通过不同浓度抗生素的作用，挑选出最敏感的基因。例如，在含有97%结核分枝杆菌基因的基因芯片上添加抗结核药物，测试药物对结核分枝杆菌基因表达的影响，了解关键基因产物的生物学功能。 通过基因体内表达确定靶标基因 作为基因学方法的补充，确定关键基因后，一般还要通过实验来确定病原菌感染脊椎动物的必需基因，因为有时细菌在培养皿中生长的非必需基因可能是感染动物和人的关键基因。基因