氨基酸类物质的荧光光谱分析.pdfVIP

仪器分析实验报告 氨基酸类物质的荧光光谱分析 zuozhe 一、 实验目的 (1)了解荧光分析法的基本原理。 (2)掌握Ls55 型荧光分光光度计的构造、原理及基本操作。 (3)掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。 二、 实验原理 荧光物质分子吸收了特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更 高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的 形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后 再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽并能提供激发光谱、 发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振等诸多信息等优点，已成为一 种重要的分析技术。但由于能够产生强荧光的物质相对较少，故其应用不太广泛。对 于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配 合物进行测定。能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π键结构或具有刚性 平面结构等特征。 氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子 蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。色氨酸(Try)、酪氨 酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。 三、 仪器与试剂 1. 仪器：Ls55型荧光分光光度计，10 mL带玻璃塞的比色管，移液管。 2. 试剂：2.0 g/L 的苯丙氨酸溶液；0.001g/L 的色氨酸溶液；0.04 g/L 的酪氨酸溶液 （所有溶液均用去离子水配制）；色氨酸待测样。 四、 操作步骤 1. 配制实验样品： −3 色氨酸标准溶液的配制：从1 ×10 /色氨酸标准溶液中分别取1mL， 1.5mL，2mL，2.5mL，3mL 的色氨酸标准溶液于10mL 比色管中，定容。 2. 仪器操作： 详见仪器使用说明 五、 实验及结果分析 1. 概述 除特殊说明外，本次实验中所用仪器参数设置如下：电压：自动；激发狭缝宽 度：7.0nm，发射狭缝宽度：4.0nm，扫描速度：1200nm/min 。色氨酸，酪氨酸和苯 丙氨酸的发射光谱测量时的激发波长分别为219nm，200nm，200nm。 仪器分析实验报告 2. 发射光谱及吸收光谱的扫描和讨论 本次实验中，对于色氨酸，酪氨酸，及苯丙氨酸的激发光谱和发射光谱测试结果 如图1。 图1. 色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸的激发光谱和发射光谱 为了便于比较三种物质的谱图差异，我们将上6 张谱图放在同一坐标系下进行比 较，如图2 所示。对于三种氨基酸的结构，如图3 所示。相比于苯丙氨酸，酪氨酸上 苯环多了一个羟基取代基，导致酪氨酸的荧光强度要强于苯丙氨酸，但其对于其发射 波长的影响不大。而色氨酸的R 基是一个吲哚环，由于吲哚的上N 原子的吸电子效 应，使环上电子密度降低，导致其荧光强度弱于苯丙氨酸和酪氨酸，同时其荧光的发 射波长变长。 仪器分析实验报告 图2. 色氨酸，酪氨酸，和苯丙氨酸的吸收光谱及发射光谱 O O O