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525 nm (20-nm bandpass) 525 (spectrally unmixed) Composite image (qd + autofluor) RGB Multispectral imaging isolates signals from autofluorescence FFPE prostate: PSMA labeled with 525-nm QDOTs FITC Component Autofluorescence Component 40x Magnification Kidney glomerulus: FITC antibody to C3 and Autofluorescence Nuance image RGB image Nuance composite image EGFR and phospho-EGFR in skin tissue RGB image DAPI phospho-EGFR EGFR Autofluorescence Nuance image: EGFR green, p-EGFR red （二）免疫酶法 优点： 1，不需要荧光显微镜。 2，衬染后组织结构显示良 好。 3，染色后切片易保存。 4，可用于免疫电镜。 （二）免疫酶法 主要应用范围： 1，多用于组织中的抗原检 测。 2，一般不要用于细胞免疫染 色中。 常用标记物及底物呈色反应 1，辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP)：为最常用者，该酶最常用的还原型染料为二氨基联苯胺（DAB，终产物为棕色）；氨基乙基卡巴唑（AEC，终产物为橘红色），4-氯1-萘酚（CN，终产物为灰蓝色）。DAB染色后用明胶封固，AEC和CN染色后用水溶性封固剂（最常用者为缓冲甘油）封固。 常用标记物及底物呈色反应 2，碱性磷酸酶（AP）为另一种常用标记酶。 可通过两反应显色： （1）偶氮偶联反应，水解?-萘酚磷酸盐为?- 萘酚后与 fast blue（终产物为蓝色）或 fast red（终产物为红色）形成不溶性沉 淀。 （2）靛蓝-四唑反应，水解溴氯羟吲哚磷酸盐 （BCIP）并将其氧化为靛蓝，而氮蓝四 （NBT）则在反应中被还原成不溶性紫色沉 淀。 常用的免疫酶法 （1）免疫酶标法：分为直接法和间接法 两种 ———————————————— 常用的免疫酶法 （2）非标记免疫酶法：最典型为PAP法 或双PAP法，APAAP法。 __________________________________- （3）亲合免疫组化法 A，SPA法（staphylococcus protein A)：原理：利用SPA与Fc受体的高亲合力，用酶标记SPA后作为酶标二抗或用于PAP法中作为桥抗。 优点：与Fc段高亲和力，染色背景淡。 缺点：不能分辩抗体种属，而形成非特异性染色；与某些IgG亚型的Fc段无亲合力，在一抗为单克隆抗体时要注意选择。 （3）亲合免疫组化法 B，生物素（biotin）~卵白素（avidin）法： 生物素分子量为244，卵白素分子量为67kD， 两者有极高的亲和力。可分为标记式（抗体 标记生物素，酶或荧光素标记卵白素）；桥 式（抗体标记生物素，酶标记生物素，卵白 素为桥，序贯上片）。ABC法（　avidin~　biotin~complex）先将生物素与卵白素形成大晶格复合物，灵敏度很高。 （4）凝集素法 凝集素是一类糖蛋白或结合糖的蛋白质，其生理功能为通过与细胞表面糖分子间的非共价键结合，使细胞发生凝集而得名。其最大特点为细胞表面糖复合物结合的专一性，故可被用于研究细胞膜表面某些糖分子的改变。可直接标记凝集素或结合使用抗凝集素抗体进行检测。 （5）受体配体法 目前有广泛的应用，如检测乳腺癌细胞的雌、孕激素受体，对手术后的化疗方案有重要的指导意义。但这一类检测逐渐被抗原抗体反应所取代。 （三）其他方法 1，免疫金银法：用胶体金标记染色后用 银放大显影，多用于免疫电镜。 2，免疫半抗原法：最常用如地高辛法 等，前应用日趋广泛。 3，放射免疫自显影法：多用于同位素示 踪，敏感性高但不能观察组织结构。 （三）其他方法 4，葡聚糖聚合物技术：原理是以葡聚糖 为骨干，与多达100个酶分子和约20 个抗体分子结合，从而大大提高了检 测的敏感性和特异性。可分为直接标 记一抗的一步法和标记二抗的两步 法。 四、非特异性着色及其对照