（推荐医学）高效液相色谱分析.ppt

选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA * 样品衍生 提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析 * 样品衍生∶氨基酸分析 * AccQ-Tag 衍生法 * 浓缩样品 浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱 * 固相萃取（SPE）技术 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中60~80%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性 * Waters的Sep-Pak小柱 Waters专门开发了固相萃取技术（SPE） Sep-Pak小柱的应用领域 除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份 Sep-Pak小柱的主要种类 反相 正相 离子交换 * Sep-Pak的种类 根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开 让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱 * 各种Sep-Pek小柱（一） 正相 包括∶Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina 可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡 加入样品 用非极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如∶NH2 / CN 确认回收率 * 各种Sep-Pek小柱（二） 反相 包括∶C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN 可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍 柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了 样品溶解在强一些极性的溶剂中 加入样品 用强极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 确认回收率 * 各种Sep-Pek小柱(三) 离子交换 包括∶Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2 可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡， 样品溶解在去离子水或弱缓冲液中 加入样品 用弱缓冲液洗脱不想要的组份 用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份 用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份 确认回收率 * Sep-Pak小柱的方法开发 SPE方法开发的几个关键因素 文献查阅 Waters有专门Sep-Pak应用资料的数据库（P/N = 88286） 查阅Waters的网页（） 流速控制 同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，1~5ml/min加载样品 离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载样品 以1~5ml/min流速洗脱样品 注意样品本底的不同 注意载荷量及加样方式 * 用Sep-Pak C18除去杂质 使极性的杂质先流出 中等极性样品流出，保留并分析 小柱及其非极性杂质丢弃 举例：多肽混合物脱盐 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把样品载入小柱 盐等极性物先流出。 用更强(极性更弱)的流动相洗出极性较弱的多肽 * 用Sep-Pak C18分组分析 样品是一