酶与细胞固定化关键技术.docVIP

第五章 酶和细胞固定化技术 教学目标：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶常见固定化技术，了解固定化酶性质。 教学关键、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范围，多种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范围,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节 概述 一、游离酶使用中不足: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以反复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术快速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基础概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在酶，能连续地进行反应，反应后酶能够回收反复利用。包含酶和不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等原因约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并含有能被反复或连续使用活力。 四、固定化酶优点 增加了酶稳定性 能降低酶总体费用 酶分离和回收变得轻易，并可反复使用 使反应过程连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶应用范围（多酶系统酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化方法 一、酶固定化方法 1、酶固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化方法 2、选择方法依据： ⑴ 酶性质 ⑵ 载体起源、价格、机械性能、载体功效基团和交联度等 ⑶ 制备方法简便易行 ⒊ 衡量依据： ⑴ 测定固定化酶活力，以确定固定化过程活力回收率； ⑵ 研究它最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶ 稳定性和不稳定原因探究； ⑷ 对酶进行人工修饰，使其和载体结合达成较为理想构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：关键是利用细胞和载体之间吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常见吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。???? 另外还可利用专一亲和力来固定细胞，比如伴刀豆球蛋白Ａ和ａ一甘露聚糖含有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引发酶变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；缺点是蛋白质和载体之间结合相当弱,而且很多情况下,酶非特异性吸附常常会引发部分或全部失活,高浓度盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质脱附.所以当要求酶固定绝对牢靠时,采取吸附法是很不可靠. 4、常见吸附剂 多种矿物质和无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常见吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成阴离子和阳离子交换剂离子交换剂关键靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质pH、温度改变时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）和酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充足洗涤，直至测不出活性为度，最终再悬浮于10ml NaAc PBS中备用。 （二） 包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在多种多空载体中，使酶固定方法。 可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：通常不需酶AA残基进行结合反应，极少改变酶高级结构，酶活回收率高；缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物扩散，有时，这种扩散会造成酶动力学行为改变，所以此法只适合于小分子底物和产物酶。 3、 海藻酸盐包埋法 海藻酸钠和Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒 缺点: 在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定. Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解 优点: 海藻酸盐价格廉价 包埋条件温和 4