DNA提 取各种缓冲液的配制.docVIP

植物总ＤNＡ得提取 一、所需仪器设备及消耗品 剪刀、塑料袋(封口)、冰箱、棕色广口瓶(１００0、50０、２00、10０、5０ml)、量筒(1０00、5００、100、1０ml)、烧杯(1000、50０、2０0、100ml)、pＨ试纸、电子天平、高压灭菌锅、研钵、液氮罐(液氮)、水浴锅、离心机、移液器(1套)、枪头(１ml、200ml、2０μｌ)、枪头盒、离心管(1。5mｌ)(包括盒与架)、一次性手套、电泳仪、电泳槽、塑料胶带(宽)、微波炉、凝胶成像系统、垃圾桶、冰盒(自制)、记号笔、单面刀片 二、所需化学药品及试剂 CTAB、ＮaCl、EＤＴＡ－Ｎａ2·2Ｈ2O、Triｓ、冰乙酸、硼酸、β—巯基乙醇、ＮaAc、氯仿(三氯甲烷)、异戊醇、无水乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、蔗糖、溴化乙锭(EB)、RNasｅ、NaOＨ、ＨＣl(浓)、ddＨ２O 三、各种缓冲液得配制 (一)2%CＴＡＢ提取缓冲液(300ｍl)(高压灭菌) 4ｍol／Ｌ得NaＣl 　３5ml×3=１05mｌ 1ｍｏl/L得Tｒis－ＨCｌ 　 １０ml×3=３0ml ０、5mｏl/L得EＤＴＡ　 　 　4mｌ×3＝12ｍl CTAB 　 　 　 　 　 2g×3=6ｇ (二)1×ＴE(母液ｐH8、0)(５0ml)(高压灭菌) 1mｏl/L得Tris—HCｌ(pH8、0) 　５0０μl 0.5mol/L得EDTA(pH8、０) 　 １00μｌ 最后加ｄdH2Ｏ定容到 　 　 50ｍl 工作液为０、1×TE(４５mｌ灭菌得ddH2Ｏ中,加入５mｌ已灭菌得1×TE) (三)4mol/Ｌ得NaCl(１50ml)(高压灭菌) 　 35.055g得ＮaCl,加ddH2O１２０ｍｌ溶解,再加水定容到1５0ｍl (四)1mｏl/L得ＮaCl(４00μl)(用于配制RNaｓｅ储存液) 　 　 取4mｏl／L得NaCｌ(已灭菌)１0０μl,加30０μｌ灭菌得ddH2O。 (五)３mol/L得NaAc溶液(pH5、2)(50mｌ)(高压灭菌) NaAc·3H２O 　　　 　　　 20。40５g 加ddＨ2O　　 　 　 　 　　 30ml 用冰乙酸调节pＨ至　 5、2 加ddH2Ｏ定容到　 ５０ml (六)RNasｅ储存液(10ｍg/ml)(1ml) 1mｏl／Ｌ得Triｓ-HCｌ(pH７。５)　 10μl 1ｍｏl／L得NａＣl 　 　　　 　 15μl RNａse 　　 　 　 　　10mg 沸水浴15~２０min (七)EＢ储存液(1ｍｇ/mｌ) ＥB 　 30mg ｄdH2O 　　 30ml 磁力搅拌至完全溶解,装入棕色瓶,铝箔包裹,保存于室温、 制胶时EB终浓度为0.5μg/ml(30ｍl加1５μl、40ml加2０μl) (八)10×TＢＥ缓冲液(电泳缓冲液)(高压灭菌) Tris碱 　 　 　 5４g 硼酸　　 　 　 　 ２7.５g 0。5ｍｏl/L得EDＴA(ｐＨ8.０) ２０ml 以上溶于40０ml得ddH2O中,在定容到500ml 工作液为1×TBE或0、５×TBE (九)６×上样缓冲液(4℃保存) 0、25％得溴酚蓝(2。5mｇ／1ｍｌ 40%(w/ｖ)得蔗糖水溶液) 4０%(w/v)蔗糖水溶液(２ｇ/５ｍl得ddH2O,加热溶解,注:温度不能太高) (十)１ｍol/L得ＨＣl溶液(不用灭菌) 8。６2 ml得浓盐酸,加灭菌ddH2O 91.3８ml,混匀,室温保存(10０ml)。 (十一)5ｍｏl/Ｌ得NaＯH溶液(５0ｍl,1０ｇ得NaOH溶于50ｍl灭菌得ddＨ2Ｏ中)(不用灭菌) 200ｇ得NaOH,溶于灭菌得ddH２O中,定容至1０00ｍl (十二)1mol/L得Tｒiｓ-HCｌ(pＨ8。０)(100ｍl)(高压灭菌) 　　 １2、11g得Ｔｒiｓ碱 8０ml得dｄH２O 加浓盐酸调节pH值至８.0(大约加4.2ｍl) (十三)0、5mol/L得EDTA(pH8。0)(５0mｌ)(高压灭菌) 　 9.305g得EＤTA—Ｎa２·２Ｈ2O 1ｇ得ＮaOH　 　 　　 　 磁力搅拌器剧烈搅拌 40ml得ddH2O 最后加水定容到50ml,用NaOＨ调节pH值至8、0 DNA定量用紫外分光光度计法,1　ＯD２6０≈50μg／ml双链DNＡ。 ＰＣR(聚合酶链反应) 一、所需仪器设备及消耗品 冰箱(４℃、2０℃)、高压灭菌锅、离心机、移液器(１套)、枪头、枪头盒、PCＲ管(包括盒与架)、PＣＲ仪、离心管(包括盒与架)、一次性手套、电泳仪、电泳槽、塑料胶带(宽)、微波炉、凝