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细胞集落形成 实验方法介绍 非整倍体无限 细胞系和癌 细胞株中，仍然存在不同 细胞亚群，它 们的功能和生 长特点有些差异，其中有些 亚群细胞对培养 环境有 较大的适 应性和具有 较强 的独立生存能力， 细胞集落率高。 纯化细胞群来自一个共同的祖 细胞， 细胞遗传 性状、生物学特性相似，利于 实验 研究。原代培养 细胞和二倍体有限 细胞系， 细胞集落率很低。 细胞集落化培养之前， 应先测定细胞集落形成率，以了解 细胞在极低密度条件下的生 长能力。 集落抑制率 = （1- （实验组 集落形成率 /对照组集落形成率））× 100% （一）原理 细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖 6 代以上，其后代所 组成的细胞群体，称为集落或克隆。 每个克隆含有 50 个以上的 细胞，大小在 0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示 细胞独立生存能 力。常用方法有平板集落形成 试验 、软琼 脂集落形成 试验。 （二） 实验 用品 1. 材料： Hela 细胞。 2. 器材：（直径 60mm ）培养皿、 细胞记数板、 烧杯、吸管、离心机、离心管、 废液瓶、倒 置显微镜、二氧化碳培养箱、超 净工作台、水浴 锅。 3. 试剂 ： Giemsa 染液、 0.25% 胰蛋白 酶消化液、血清 细胞培养液、安 尔碘、 琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成 试验 本法适用于 贴壁生长的细胞，包括培养的正常 细胞和 肿瘤细胞。 对指数生 长期细胞，采用常 规消化 传代方法，制成 细胞悬液。 细胞悬液反复吹打，使 细胞充分分散， 单个细胞百分率 应在 95% 以上。 细胞记数，并用培养基 调节细 胞浓度，待用。 (3) 根据 细胞增殖能力，将 细胞悬液倍比稀 释。一般按照每皿含 50 、 100 、 200 个细胞的 浓度 分别接种 5ml 细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向 轻轻晃动培养皿，使 细胞 分散均匀。 培养皿置 37 ℃ 、5%CO2 中培养 2~3 周，中间根据培养液 pH 变化适时更换新鲜培养液。 当培养皿中出 现肉眼可 见克隆时，终止培养，弃去培养液， PBS 液小心浸洗 2 次，空气干 燥。甲醇固定 15 分钟，弃甲醇后空气干燥。用 Giemsa 染液染色 10 分钟，流水 缓慢洗去染 液，空气干燥。 2.软琼 脂集落形成 试验 本法适用于非 锚着依 赖性生 长的细胞，如骨髓造血干 细胞、 肿瘤细胞株、 转化细胞系。利用 琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将 肿瘤细胞混入 琼脂液中， 琼脂液凝固使 肿瘤细胞置于一 定位置， 琼脂中 肿瘤细胞可能向周 围作全方位的移 动，因此可以用来 检测肿 瘤细胞的主 动移 动能力。 肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以 测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系 统软琼 脂集落形成 试验 方法相同，主要用于有关 细胞分化的研究，但使用培养基不同。 1）同上（ 1）~（3）步 骤。 2 ）调整细胞悬液密度 为 1×103 个 /ml 细胞。 3 ）制备底层琼 脂，完全溶化的 5% 琼脂和 37℃ 左右 预温的新 鲜完全培养液以 1 ：9 比例在 40 ℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含 0.5% 琼脂培养基 2ml ，室温下 琼脂完全凝固。 （ 4 ）制备上层琼脂 ,取 37 ℃ 不同密度梯度 (按照每皿含 50 、 100 、 200 个 )的细胞悬液 1.5ml 移入小 烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体 积混匀，即成 0.25% 半固体 琼脂培养基。配好的半固体 琼脂培养基立即加入 铺有底 层琼脂的培养皿中，室温下 琼脂凝固。 37 ℃ 、5%CO2 静置培养 2-3 周。 （四） 实验结 果 1.定期 观察细胞培养 过程中集落的形成。 2.显微镜下计数大于 50 个细胞克隆数，然后按下式 计算集落形成率： 集落形成率（ %） =（集落数 /接种 细胞数）× 100 （五）注意事 项 1.琼脂对热和酸不 稳定，如果反复加 热，容易降解， 产生毒性，同 时琼 脂硬度下降。故 琼脂高压灭 菌 ( 10 磅 15 分钟 )后按一次用量 进行分装。 2. 细胞悬液中， 细胞分散度 95% 。 3. 软琼 脂培养 时，注意 琼脂与 细胞混合 时温度不要超 过 40℃ ，以免 烫伤细 胞。 4. 接种 细胞密度不宜 过高。 5. 细胞在低密度条件下培养，生存率明 显下降，无限 细胞系和 肿瘤细胞株克隆形成率一般在 10% 以上。但初代培养 细胞和有限 细胞系 仅为 0.5~5%, 甚至 为零。为提高集落形成率， 必要时在培养基中添加胰 岛素、地塞米松等促 细胞克隆形成物 质。