临床色谱质谱检验技术：第五章 液相色谱质谱技术（三）.pptVIP

内标物纯度不够或对非标记物有干扰贡献时，加入的浓度应以不影响被分析物的定量下限（LLMI）的准确定量为准； 加入内标物的浓度不宜过低，应以可重复性较强为准（如：定量下限的10-50倍）； 加入的内标必须能与样本溶液均匀混合，但不发生化学反应（避免降解或转化），特别是存在内源性结合蛋白的情况下。 液相色谱方法建立—内标选择 其他考虑 可获得、货源稳定； 稳定的同位素标记形式，比待测物的分子量大3Da以上，纯度高，且在断裂中不会丢失同位素标记结构； 内标物对待测物有贡献时，应控制该贡献的响应值小于定量下限响应的20%； 应保障使用的内标物浓度，在仪器上的响应处于线性范围内； 应保障内标物的响应，在标准曲线最高点响应的60-80%范围内； 液相色谱方法建立—内标选择 定义 样品中除分析物以外的其他成分对待测物测定值的综合影响，由基质引起的响应信号增强或降低的现象分别称为基质增强效应和基质减弱效应。 基质来源 内源组分：指生物样品中存在的有机和无机成分，经前处理后仍存在于提取液中。包括电解质、盐类、强极性化合物以及各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、脂类、肽类及其分析目标物的同类物及其代谢物） 外源组分：包括塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、清洁剂（烷基酚）、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、流动相等。 基质效应的考察 在内源性组分中，引起基质效应的最主要是磷脂、蛋白质，其中磷脂类化合物磷脂酰胆碱作为两性化合物，在ESI、APCI两种电离方式（正、负离子模式）下均能引起离子抑制。 同待测物共流出，在液滴汽化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面的电子，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，产生所谓的基质抑制或基质增强效应。 基质效应—内源性组分 基质效应—内源性组分 正常 正常 脂血+++ 基质效应—外源性组分 异常谱图（用药） 正常谱图 基质效应—评价方法 提取后加入法 绝对基质效应 前者是空白基质样本经前处理后添加待测分析物（标准品）与相同浓度标准品的信号响应的差异，它影响分析方法的准确度，能够得出基质抑制或基质增强的绝对比例，无法评估基质对整个进样过程的影响。 相对基质效应 通过比较各个不同来源（不同批次）样本的信号响应差异来评价分析方法的精密度。 基质效应—评价方法 柱后流动注射 基质效应—消除 改进样品的前处理方法，净化样品——最有效的方式 优化色谱条件，使分析物与内源性干扰物质色谱分离 改善质谱条件 使用同位素内标 使用灵敏度更好的仪器，减少进样量 采用基质标准溶液校正 三、小节与思考 《临床色谱质谱检验技术》 液相方法的建立（流动相、洗脱设置、色谱柱、内标选择） 基质效应的考察 Thanks 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系,在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离,并依次随流动相流至检测器,检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存. * 了解样品在流动相中的溶解度(防止其在流动相中析出)； * 防止键合相流失 * * 即使采用易挥发盐的缓冲液，应尽可能采用低浓度，在ESI过程中存在歧视效应，即离子化效率（或浓度）高的化合物的存在会抑制离子化效率（或浓度）低的化合物的离子化进程，从而使后者信号减弱甚至缺失。对于选用APCI离子化方式时，通常其离子化效率低于ESI，而对盐的耐受能力优于ESI，即使如此，也应采用低浓度缓冲盐溶液。 * 梯度洗脱的原理： 流动相由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子k,并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离. * 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小); 颗粒分布越宽:柱效低; 长度: 分离度，理论塔板数; 提高柱效的途径—选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速，获得较小的塔板高度H * 常规分析柱、快速分析柱、超快速分析柱；柱长，内径；粒径；填料基质； 速率理论→范.弟姆特方程：H = A + B/u + C·u；H：理论塔板高度，u：载气流速，A：涡流扩散项；B：分子扩散；C：传质阻力 载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速?，柱效?； 载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速?,柱效? * 色谱柱的规范使用：防止堵塞，漏液，使用前未平衡好，进样量过载，在线过滤器滤芯更换等。 冲洗色谱柱，延长使用寿命；存放前的处理：除去杂质、缓冲盐；使用合适的存放溶剂及存放温度；避免机械震动； * 因此需优化色谱条件，使可能对质谱分析造成干扰的基质成分与内标分离，防止交叉干