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高效液相色谱 仪器分析实验教案 仪器分析实验 课程教案 实验名称：高效液相色谱混合物的定量和定性测定 实验类型 验证性 教学时数 7 每组人数 8 一、实验目的及要求： 1．掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法； 2 ．了解高效液相色谱的构造、原理； 3 ．学习高效液相色谱仪的操作。 教学重点： 1、溶液配制的条件 2、色谱工作站参数的设定。 3、定量定性分析方法 教学难点： (1)、学习高效液相色谱的使用方法、了解该仪器的结构； (2)、定量定性分析方法 二、实验原理 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液 器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内， 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多 次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次 从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。 三、主要仪器和试剂 主要仪器：安捷伦 1260 液相色谱仪，配有紫外检测器，Phenomenex ODS 柱] ； 1 自动进样器。 试剂：色谱纯甲苯、苯、丙酮、甲醇、超纯水； 未知样品 1、2、3、4 。 教学内容及过程 第 1 页第 1 页 高效液相色谱 仪器分析实验教案 （一）检查实验预习报告 （二）上次实验存在的问题 （三）高效液相色谱操作 （四）实验内容及步骤 A 、溶液配制 1 配制标准系列溶液 三组分混标液：每 mL 溶液分别含 5 uL 苯、甲苯和丙酮。 分别准确移取 0、2.50、5.00、10.00 和 20.00 uL 甲苯容易溶于 1.00mL 甲醇中。 2 流动相的配制、过滤和除气。 标准苯测试液。 未知样品 1 号、2 号、3 号和 4 号。 B、上机测定 1 更换流动相。 2 按操作规定开动仪器，排气后让色谱柱平衡（流动性为 80% 甲醇，速度 1.0 mL/min）。 3 设置色谱工作站参数。 Agilent HPLC 仪 色谱柱： 流动相：甲醇：水=8 ：2 流速：1.0 mL/min 检测波长：254nm 进样体积：10 μL 4 进样、采集色谱图。 1）三组分混标液 2 ）标准溶液系列 3 ）未知样品 5 色谱数据分析，打印色谱图及分析报告。 6 更换甲醇流动相，清洗色谱柱。 7 关闭仪器。 第 2 页第 2 页 高效液相色谱 仪器分析实验教案 （五）提问 1、高效液相色谱溶液配制需要注意哪些操作？ 答：药品需要色谱纯的；配制好的溶液需要抽气处理——这步操作有些高效液相色谱能 自动完成。 2、利用高效液相色谱进行定量和定性分析的依据有哪些？ 答：定性分析根据相同色谱系统下同一物质的保留时间相同；定量分析的依据是在一定浓度 范围内，浓度与峰面积(或峰高)成正比。 （六）数据记录与结果处理 确定样品内的物质，确定样品中甲苯的浓度。 1）定性分析实验记录 2 ）定量分析实验记录 丙酮浓度（ul/mL） 峰面积（uV*s） 第 3 页第 3 页 高效液相色谱 仪器分析实验教案 标样1 50 1875145 标样 2 75 28