血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告.pdfVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 血清清蛋白 γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5 倍行距；数字、英文用 Times New Roman ；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提（盐析法）： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。 当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电 离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电 荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质 颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析， 便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐（凝胶层析法） 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中 分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所 以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进 入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目 的。 3、纯化（离子交换层析法） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换 剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的 DEAE 纤维 素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子 则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血 清中各种蛋白质的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷 不同，可以通过 DEAE 离子交换层析将血清清蛋白和 γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和 γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血 清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。 三、材料与方法：以流程图示意 材料： 1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生） 2、试剂：0.3mol/L 的PH6.5 醋酸铵缓冲液、0.06mol/L 的PH6.5 醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、 1.5mol/L 的 NaCl-0.3mol/NH Ac 溶液、饱和硫酸铵溶液、 4 0.92mol/L （20% ）磺基水杨酸、0.05mol/L （1%）BaCl2 溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓 冲液、漂洗液。 3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑 色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、 电泳槽、直流稳压电泳仪。 方法： 粗提 脱盐 纯化 纯度鉴定 （盐析法） （凝胶层析法） （离子交换层析法） （电泳） 取血清0.8ml ，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml ， 混匀室温放置 10min，4000r/min 离心 10min 盐 析 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml 溶解 上清液（含清蛋